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第1篇

【關鍵詞】歷史教學；問題意識；培養興趣

新世紀面對著新課程改革，作為歷史教學者應該怎樣去做呢？這是每一位一線歷史教師多年來一直思考的問題。目前的教學工作總是提到，要緊扣課程標準，圍繞教學大綱，開展教育教學工作，同時還要體現新課程的理念，這就無形中給教師教學工作增加了巨大的壓力。一堂課究竟怎樣上才能最大限度的發揮教師的輔導性和學生的主動性，體現以學生為主體的優勢，利用45分鐘最大限度地激發和調動學生的積極性和潛能，讓其每個學生都參與到教學中去，同時又能在以后應試教育和素質教育相結合的教育中取得良好的成績，又能在教育教學中培養高尚的情操和愛國主義教育，樹立遠大理想，為實現偉大復興中國夢做貢獻。這就需要教師研究中學歷史教學問題意識，培養學生歷史問題意識，然后指導、解決。

目前，中學歷史教學觀念的滯后性、中學生缺乏歷史學習中的問題意識，與當前社會、學校等歷史教學觀念的滯后性有著密切的聯系。教師選定每一課每一個問題、指導學生去解決而不是讓學生提問題，然后想辦法去解決問題，這是傳統課題的教學方法和方式。因此，在當前新課改以素質教育不斷深化的過程中，歷史教學的問題意識要改變、要轉變，歷史教學的本質、目的、過程等都應當有所改進和提高。

另外，中學歷史教學的手段貧乏和單一，歷史教學大多是以課本為主，并且以平面化的文字、圖片為主，過分理論和政治化、缺乏時尚感和生活化，從而也弱化了學生的學習興趣。這就要每一位中學歷史教師的努力和研究，創造性地進入教學。

一、培養中學生“問題意識”啟發學生的積極性

在教學實踐中，中學歷史的課堂教學方法是多種多樣的，其功能和作用也各不相同。在當今新課程課堂教學的過程中，中學歷史教師應當結合學生的年齡特征和認知能力，選擇和運用適當的教學內容和素材及歷史故事和要件，更新教學觀念，采用不同方法和途徑，構建問題平臺，搭建教學舞臺，讓學生參與，注重學生的能力，培養學生的質疑能力，使其提出問題、研究問題、從而解決問題。

二、培養中學生對歷史課程的興趣，激發創造性學習的能力

愛因斯坦曾經說過，“興趣是最好的老師”。強烈的好奇、濃厚的興趣，是學生們產生提出問題的前提。教師應動用一切教學手段和方法，努力培養學生的興趣，激發他們提出問題、探究問題并解決問題。例如：教師可以通過向學生展示歷史歌曲、播放歷史影像材料、展示歷史圖片、利用家鄉歷史素材（鄉土教材），讓學生出演歷史短劇等形式，讓學生自己去琢磨歷史、觸摸歷史、理解歷史、感知歷史、走進歷史、學習歷史，對歷史產生強烈的好奇和豐富的想象力，并將好奇心轉化為持久的精神動力。

三、改變傳統教學方式和觀念，鼓勵學生提出問題，一切創造始于“問題”

在初中歷史教學的過程中，教師要進行繼續學習和教育，增加知識，更新知識，研究問題、整合知識，絕不能在知識層面上止步不前，二是應當大膽地改變傳統的歷史教學理念和方式，鼓勵學生們提出問題、樹立問題意識的理念，并讓課堂教學成為提出問題、探究問題、解決問題的思維實驗室。

四、加強歷史教研和教研組內文化建設

教研和教研組的建設和存在的目的在于教學研究，教學質量的提升、教學問題的解決、教學經驗交流交換和積累，團結和諧的教學教研氛圍是舒適的工作環境和高水平的教育教學的保證。成員之間相互信任、注重交流、研究和探討、尊重和支持，可以優勢互補、群策群力、共同進步，完成教學，以便更多的解決學生可能發現提出的問題。

第2篇

關鍵詞：政府管理創新，生態系統，意義，概念，特征

 

一、政府管理創新生態系統的提出

政府管理創新生態系統作為學術范疇而被嚴格界定和科學論述，嚴格地說是從經濟體制轉軌和社會結構轉型背景下人們對政府管理活動進行新途徑、新方式、新模式和新機制的探索開始的。在學術界，諸多專家和學者對政府管理創新問題有著研究興趣，并撰寫出相應的理論成果，對于指導政府管理創新實踐具有指導意義和價值，但多數研究僅僅局限于政府管理實踐活動層面上，沒有突破政府管理學的理論境遇和思維邏輯，難以擺脫傳統政府管理創新理論的羈絆與禁錮，認為政府管理創新就是管理理念的革新、管理方法的改進和管理內容的變更和管理手段的變換,將政府管理創新視為外在于管理環境而獨立存在的實踐活動。

近年來，一些學者將政府管理創新研究的主題轉向了理論分析的方法論層面。生態學強調生物與環境之間的協同共生和持續演化，其所內涵的動態、多樣、平衡和有序的思想使得其逐漸成為分析社會現象和問題的有效工具。如果將政府管理創新置于生態學的理論視野內加以審視，可以發現：政府管理創新是一個復雜的有機整體，其與所依存的外部環境之間存在著相互作用、相互影響、相互促進的協同關系和共生關系；不論在構成要素方面，還是在要素之間關系方面，乃至要素與外部環境之間關系方面，政府管理創新都處于一個構成要素多樣、環境因素復雜的生態系統中，可以將這個系統理解為“政府管理創新生態系統”。

作為社會生態系統的典型形態，政府管理創新生態系統的正常運作必須具備三方面的條件：第一，必須由人和人圍繞的政府管理創新要素、條件、活動組成。人和政府管理創新要素、條件、活動既是政府管理創新生態系統的最基本構成要素，也是政府管理創新生態系統得以存在的基礎和實際載體。第二，基本構成要素之間、要素與環境之間、環境與環境之間存在相互作用和相互聯系的機制。第三，具有特定的功能，這是整體具有不同于各個組成要素的新功能，這種新功能是由系統內部的有機聯系和結構決定的，而單個構成要素則不具備，一旦特定功能被取代，系統就會面臨升級轉型或者解體消亡。只有同時具備這三個條件，政府管理創新生態系統才是所謂的生態性政府管理創新生態系統，任何條件的不具備或者不完全具備，都會影響到政府管理創新生態系統的生態活度。

二、政府管理創新生態系統的意義

首先，有利于培養政府管理創新的生態認知。認知是行動的先導，認知水平的高低直接決定行動過程及結果的績效水平。目前，一些地區政府在進行管理創新時，既不充分了解自身的管理實踐情況，也不全面顧及政府管理創新的內外環境，進而造成政府管理創新過程的不通暢和創新績效的不明顯，嚴重影響了政府管理創新活動的順利開展。通過營造政府管理創新生態系統，梳理政府管理創新要素的內在關系，規整政府管理創新的各種環境條件，實現要素關系和環境條件的動態平衡與協調統一，有利于培養政府管理創新主體的生態認知，使其在政府管理創新過程中既注重要素、環境條件的客觀性，也強調要素關系和環境條件利用的差異性和整體性。

其次，有利于提高政府管理創新的生態價值。生態文明的不斷崛起和生態意識的漸入人心，使得生態理念逐漸成為指導人們社會實踐活動的主要理念，人們在評價實踐活動價值時，不僅考慮實踐活動的社會價值和經濟價值，也越來越考慮到實踐活動的生態價值。對于政府管理創新而言，生態價值也是其追求的價值目標之一。每個政府管理創新活動都可以視為一個生態系統，構成這一生態系統的基本要素，例如創新主體、創新對象、創新內容、創新手段、創新機制等，由于它們在生態系統中的角色和地位有所差異，因而這些構成要素的生態位也各不相同。論文參考，意義。每個要素生態位的錯位都會直接影響到系統內部要素關系的穩定，進而影響到政府管理創新生態系統的有序發展。這也正是目前部分政府管理創新績效不明顯的原因所在。論文參考，意義。通過營造生態系統，來實現政府管理創新要素功能和要素關系的最優化，進而提高政府管理創新的生態價值。

最后，有利于增強政府管理創新的競爭優勢。對于政府管理創新主體而言，對自身情況和內外環境條件的準確認知是其合理利用內外環境因子，充分發揮管理創新競爭優勢，實現持續穩定發展的重要基礎。同時，也要有效調節系統內部各要素之間的生態關系，使它們能夠最大限度地發揮各自的功能作用。要素和要素之間關系的重疊競爭，要素和環境之間關系的無序紊亂，都會造成政府管理創新要素之間的功能妨害與效能內耗，進而影響到政府管理創新競爭優勢的提高。為此，在內部層面就需要保持政府管理創新要素之間關系的有序穩定，在外部層面就需要保持政府管理創新要素與外部環境之間正常的物質循環、能量流動和信息傳遞。內外層面的有機結合形成平衡有序的生態系統，使得政府管理創新過程得以持續開展，競爭優勢得以有效提高。

三、政府管理創新生態系統的特征

在持續不斷的運作過程中，政府管理創新生態系統逐漸形成了協同共生的內外環境關系，體現出整體性、層次性、復雜性、動態性和自校性等基本特征。

1.整體性。與自然生態系統相類似，政府管理創新生態系統也具有一定的空間形態。它是政府管理創新生態系統在不斷適應內外環境變化過程中形成的，是政府管理創新生態系統與內外部環境相互適應、相互作用的結果體現。空間形態既可以表現政府管理創新生態系統的空間結構，也可以反映政府管理管理生態系統的未來發展取向；既可以為政府管理創新目標的確定、創新方向的把握和創新戰略的制定提供客觀依據，也可以為相關

主體了解政府管理創新的本質和規律提供重要參考。論文參考，意義。政府管理管理生態系統的空間形態主要由社會空間、經濟空間和自然空間組成，社會空間是政府管理創新生態系統存在和發展的重要條件，主要包括政治空間、教育空間、文化空間、科技空間和制度空間等；經濟空間是政府管理創新生態系統存在和發展的基礎條件，也是政府管理創新生態系統價值目標的主要指向；自然空間是政府管理創新生態系統存在和發展的根本條件，也是政府管理創新生態系統需要深入研究和分析的空間范圍。自然空間對政府管理創新生態系統的影響具有直接性和客觀性。三個空間之間相互影響，相互作用，形成有機統一的空間形態，共同制約政府管理創新生態系統的生存發展。論文參考，意義。

2.層次性。結構是要素之間關系的結合形式和聯系狀態。系統結構是系統內部構成要素之間的關系狀態以及各要素之間的比例特點。政府管理創新生態系統的結構就是組成政府管理創新生態系統的各要素之間的聯系形式以及各要素與外部環境之間的關系形式。論文參考，意義。由于政府管理創新生態系統既是社會生態系統的子系統，也是一個具有相對獨立功能和發展演化規律的有機系統，因此，政府管理創新生態系統的結構既表現社會生態系統的部分性質，也表現有別于其他生態系統的特征。從規模大小上，政府管理創新生態系統結構可分為宏觀結構、中觀結構和微觀結構。宏觀結構主要以社會環境結構為背景，中觀結構主要以區域社會環境結構為背景，微觀結構主要以某個政府的具體管理環境為背景。從時空維度上，政府管理創新生態系統可分為縱向結構和橫向結構，縱向結構主要是各級政府行政級別的大小不同形成的結構，橫向結構主要是同一級別政府部門形成的結構。宏觀中觀微觀結構相互滲透、縱向橫向結構彼此交融，共同形成動靜結合、縱橫交錯的政府管理創新生態系統的網絡結構。

3.復雜性。政府管理創新生態系統是由生態主體和生態環境組成的有機系統。政府官員、政府工作人員和政府管理創新研究人員等構成政府管理創新生態系統的生態主體；對生態主體產生作用和影響的各種生態因子的結合構成政府管理創新生態系統的生態環境，主要包括社會生態環境、經濟生態環境、自然生態環境等，各層面環境都不同程度地對政府管理創新生態系統運作產生影響。不同的生態主體擁有不同的生態環境，同一生態主體在不同的發展時期也需要不同的生態環境。通過生態主體之間及其與生態環境之間的相互作用，政府管理創新生態系統形成了適應環境的能力、影響環境的能力，并不斷實現從低級到高級、從簡單到復雜、從無序到有序的發展演化。隨著經濟體制轉軌和社會結構轉型，經濟發展的快速化、社會競爭的激烈化、人際關系的復雜化和利益主體的多元化日漸明顯，分配差距的拉大、腐敗現象的蔓延、階層分化的多元等社會問題也開始出現[1]，使得政府管理創新生態系統的生態環境更加復雜，給政府管理創新生態系統的運作發展帶來了一定挑戰。

4.動態性。在生態學的理論視域中，生態因子是指對生物的生長發育具有直接或間接影響的外界環境要素。論文參考，意義。生態因子與生物之間的相互作用相當復雜，各種生態因子的有機結合形成生態環境，每個生態因子都具有不可替代性或可調劑性。同樣，組成政府管理創新生態系統的生態環境的因子都是生態因子，各種生態因子對政府管理創新生態系統的發展起著推動或者制約作用。按照表現形式，政府管理創新生態系統的生態因子可分為社會生態因子、經濟生態因子和自然生態因子，社會生態因子包括文化因子、教育因子、社會制度與政策因子、國際政治因子和科學技術因子；經濟生態因子包括消費市場因子、物資市場因子、資金市場因子、勞動力市場因子、產業與產業結構因子、交通因子、通訊因子、國際經濟因子；自然生態因子包括地域地緣因子和自然資源因子。[2]各種生態因子相互促進、相互聯系、相互制約，任何生態因子的變化，必然會引起其他生態因子的變化，進而影響政府管理創新生態系統的發展。

5.自校性。與自然生態系統不同，政府管理創新生態系統的自校平衡性更具有主動性，這是由于政府管理創新生態系統的主體——人具有更強的意識性和能動性。政府管理創新生態系統并不是完全受制于外部環境，它會根據自身的實際情況和環境發展變化的具體要求，來不斷適應環境變化。從過程機制上看，自校平衡主要是由政府管理創新生態系統與外部環境之間的物質循環、能量流動和信息傳遞的不平衡所致。物能流轉的不平衡往往會帶來政府管理創新生態系統內部結構、功能的不穩定，影響政府管理創新生態系統的正常運轉。為了保持系統內外環境關系的平衡有序，政府管理創新主體就需要采取相關措施加以解決。這些措施大致可以分為兩個方面：一是政府管理創新主體通過優化關系結構、調整功能機理和整合運作機制來保持與外部環境之間關系的平衡有序；二是通過適當改變環境因子、規整環境條件和調試環境空間來實現與外部環境之間關系的協調統一。

參考文獻：

[1]李景春.研究生黨建創新的SWOT分析[J].學位與研究生教育.2006,(8):46-50

[2]梁嘉華等.企業生態與企業發展:企業競爭對策.北京:科學出版社.2005:22-25

第3篇

【關鍵詞】 杯狀細胞

【Abstract】 AIM: To investigate the effects of human calciumactivated chloride channel 1 (hCLCA1) on synthesis of mucin in airway goblet cells. METHODS: Recombined eukaryotic expression plasmid pIRES2EFGP/hCLCA1， which contained fluorescence tag and G418 screening flag was constructed. The plasmid was stably transfected into NCIH292 cell line， which was regarded as goblet cell model in vitro. Transfected NCIH292/hCLCA1 cells were identified by fluorescence microscopy and hCLCA1 mRNA was detected by RTPCR. Cells were pided into four groups with or without hCLCA1 inhibitor NFA: ① NCIH292; ② NCIH292/hCLCA1; ③ NCIH292+NFA; ④ NCIH292/hCLCA1+NFA. The proliferation of the cells in all groups was detected using MTT colorimetry. The expression of mucin MUC5AC protein and mRNA was examined with PAS staining and RTPCR assay， respectively. RESULTS: NCIH292/hCLCA1 cells that stably expressed hCLCA1 were obtained. The proliferation capability， mucin protein expression and mRNA level of NCIH292/hCLCA1 cells were all significantly higher than those of untransfected cells. NFA markedly inhibited the above changes of NCIH292/hCLCA1 cells. CONCLUSION: hCLCA1 promotes the proliferation and mucin synthesis in airway goblet cells. This study indicates that the inhibition of hCLCA1 may be a potential treatment for asthma.

【Keywords】 asthma; airway; epithelial cells; goblet cells; chloride channel

【摘要】 目的： 探討人激活Cl通道I型（hCLCA1）在氣道杯狀細胞合成黏蛋白中的調控作用. 方法： 以人氣道黏液上皮細胞系NCIH292作為杯狀細胞特性研究的體外模型，構建攜帶熒光蛋白標簽的真核表達質粒pIRES2EFGP/hCLCA1，轉染NCIH292細胞，用G418篩選穩定表達hCLCA1的細胞NCIH292/hCLCA1. 對被轉染細胞采用熒光顯微鏡和RTPCR法檢測hCLCA1 mRNA. 根據NFA（hCLCA1阻斷劑）干預與否，將細胞分為4組： ① NCIH292；② NCIH292/hCLCA1；③ NCIH292+NFA；④ NCIH292/hCLCA1+NFA. MTT法檢測各組細胞的增殖活性；PAS特染法檢測各組細胞黏液糖蛋白的表達狀況， RTPCR法檢測黏蛋白MUC5AC mRNA水平. 結果： 經過500g/L的G418篩選，證實獲得NCIH292/hCLCA1細胞. 對各組細胞檢測結果表明，NCIH292/hCLCA1細胞的增殖活性、黏液糖蛋白表達量及MUC5AC mRNA水平均顯著高于親本細胞，并且NFA能有效抑制NCIH292/hCLCA1的這些生物活性改變. 結論： hCLCA1能有效促進氣道杯狀細胞的增殖能力及黏蛋白合成，早期阻斷hCLCA1可能是哮喘防治的有效途徑之一.

【關鍵詞】 哮喘；氣道；上皮細胞；杯狀細胞；氯化物通道

0引言

氣道上皮杯狀細胞增生及伴隨的黏蛋白高分泌是哮喘的主要病理特點之一，并已成為病情加重的指征［1］. 杯狀細胞產生的黏蛋白MUC5AC被認為是該細胞增生的標志［2］. NCIH292是一種人氣道黏液上皮細胞系，能產生多種黏蛋白，常被作為杯狀細胞功能特點研究的體外模型［3］. Hoshino等［4］和Toda等［5］相繼證實，哮喘患者氣道杯狀細胞的人鈣激活Cl通道I型（human calciumactivated chloride channel， hCLCA1）高表達. hCLCA1屬于一種新近發現的跨膜陰離子通道家族，一般認為該家族與胞膜轉運水和電解質的功能相關. 我們擬利用體外培養NCIH292細胞，探討hCLCA1與黏蛋白合成的關系.

1材料和方法

1.1材料

人氣道黏液上皮細胞系NCIH292(西京醫院呼吸內科實驗室保存)；pcDNA3.1(+)/hCLCA1質粒(美國Levitt RC教授惠贈)；CLCA阻斷劑NFA（niflumic acid）(Sigma公司)；大腸桿菌JM109及真核表達載體pIRES2EGFP（具有雙順反子）（第四軍醫大學生物化學與分子生物學教研室）；γTaq DNA多聚酶、T4 DNA連接酶及限制性內切酶NheⅠ， XholⅠ （TaKaRa公司）；RevertAidTM逆轉錄試劑盒（Fermentas公司）.

1.2方法

1.2.1pIRES2EGFP/hCLCA1表達質粒的構建采用NheⅠ和XholⅠ從質粒pcDNA3.1(+)/hCLCA1中切出hCLCA1基因片段，將其亞克隆入相同酶切的載體pIRES2EGFP，重組質粒命名為pIRES2EGFP/hCLCA1. 轉染大腸桿菌JM109感受態細胞，鋪板（含卡那霉素），挑克隆，酶切電泳鑒定. 測序鑒定由上海鼎安科技公司完成.

1.2.2細胞轉染及篩選① 新霉素（G418）濃度的確定以細胞密度4×105 /孔將NCIH292細胞接種于24孔板中，采用含100 mL/L滅活小牛血清的DMEM進行培養，并分別加入梯度濃度G418（200， 300， 400， 500， 600， 700， 800 g/L）. 培養10~14 d，選擇能全部殺死細胞所用G418的最低濃度. ② 轉染與篩選參照Lipofect AMINE 2000TM試劑說明書，在Lipofectin介導下將pIRES2EFGP/hCLCA1轉染NCIH292細胞. 72 h后，改用含G418培養液篩選3~4 wk. 獲得的細胞命名為NCIH292/hCLCA1.

1.2.3轉染細胞鑒定① 熒光顯微鏡下觀察細胞熒光蛋白表達情況. ②分別收集轉染細胞NCIH292/hCLCA1和親本細胞NCIH292，經TRI REAGENT抽提細胞總RNA，按照RevertAidTM逆轉錄試劑盒產品說明操作步驟，合成cDNA第1鏈，紫外吸收法定量后，用PCR法擴增目的片段. 參照文獻［3］合成hCLCA1及內參照GAPDH的上下游引物. hCLCA1 5′端引物： TGA TGC TAC TAA GGA TGA C，3′端引物： TTC CTC AGA GTT GGC TTC CT. GAPDH 5′端引物： ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC，3′端引物： TCC ACC ACC ACC CTG TTG CTG TA. hCLCA1循環參數： 94℃變性30 s， 63℃退火1 min，72℃延伸1 min； GAPDH循環參數： 94℃變性20 s， 59℃退火20 s， 72℃延伸20 s；均循環35次. 各PCR擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

1.2.4細胞分組根據NFA干預與否分成4組： ① NCIH292；② NCIH292+NFA，待細胞長至對數生長期，加入終濃度為100 mg/L的NFA干預24 h; ③ NCIH292/hCLCA1；④ NCIH292/hCLCA1+NFA，干預方案同②. 各組實驗重復5次.

1.2.5MTT法檢測細胞的增殖活性將各組細胞以5×104/孔種植于96孔培養板，待NFA干預24 h后，每孔加入MTT溶液200 μL，繼續培養4 h. 去上清，每孔加入DMSO 200 μL. 輕度振蕩混勻后，用酶聯免疫吸附測定儀測定A490 nm.

1.2.6PAS特染法檢測細胞黏液糖蛋白的表達取各組細胞爬片，高碘酸氧化液中浸泡10~20 min. 蒸餾水洗2次. Schiff液染色10 min. 流水清洗5 min. 用Harris明礬蘇木精襯染核2~3 min. 5 mL/L鹽酸乙醇分化30 s，自來水沖洗5 min返藍. 系列乙醇脫水，二甲苯透明，封片.

1.2.7RTPCR法檢測黏蛋白MUC5AC mRNA同1.2.3中RTPCR步驟，合成各組細胞cDNA第1鏈后，進行目的片段的擴增. 參照文獻［6］合成MUC5AC的上下游引物，MUC5AC 5′端引物： TCC GGC CTC ATC TTC TCC，3′端引物： ACT TGG GCA CTG GTG CTG. 94℃變性30 s，60℃退火50 s， 72℃延伸50 s，循環35次. GAPDH為內參照. 利用ImageTool 3.0圖像分析軟件，測量各組MUC5AC條帶與GAPDH條帶的灰度值.

統計學處理： 實驗數據以x±s表示，通過SPSS 10.0軟件進行統計分析. 多組間比較采用析因設計資料的方差分析.

2結果

2.1重組質粒pIRES2EGFP/hCLCA1的鑒定將質粒pIRES2EGFP/hCLCA1用NheⅠ和XholⅠ雙酶切后電泳，得到5300 bp和2900 bp 2個片段，分別與載體及目的基因的預期大小一致. 初步說明重組表達質粒的構建正確（Fig 1）. 測序結果顯示，目的基因片段的序列與GenBank中No.AF039400的登錄序列完全相同.

2.2細胞轉染效果梯度濃度G418的干預結果表明，500 g/L為最適篩選濃度，連續篩選3 wk. 倒置顯微鏡下觀察，所有存活細胞呈現單層貼壁生長的梭性或多邊形，與親本NCIH292細胞形態相似. 熒光顯微鏡下觀察可見，NCIH292/hCLCA1細胞的整個胞體顯現出淡綠色熒光，尤以胞核明顯. RTPCR法檢測hCLCA1 mRNA水平，電泳結果可見NCIH292/hCLCA1細胞組在預期523 bp處出現清晰條帶，而親本細胞組為陰性. 其中GAPDH cDNA大小為411 bp （Fig 2）. 標簽蛋白翻譯水平和目的蛋白轉錄水平的檢測均表明，重組質粒pIRES2EGFP/hCLCA1轉染及表達過程成功.

2.3細胞增殖活性與NCIH292細胞組相比，NCIH292/hCLCA1細胞組的A490 nm值顯著升高（P

2.4細胞黏液糖蛋白的表達NCIH292/hCLCA1細胞的胞質普遍出現深紫紅色顆粒；而其他3組的細胞胞質均呈很淡的紫紅色，且著色程度相近（Fig 4）.

2.5黏蛋白MUC5AC mRNA水平由Fig 5電泳結果可見，各組均在預期679 bp處出現特異性條帶. NCIH292/hCLCA1細胞組的灰度值（235±3）明顯高于NCIH292細胞組（173±3）和NCIH292/hCLCA1細胞+NFA組（180±5）（均P

3討論

黏液糖蛋白主要由杯狀細胞產生，是氣道粘液層的主要成份，并能使黏液具備彈性和粘附性的生理特性. 然而，杯狀細胞異常增生或化生及由此產生的氣道黏液高分泌，是哮喘的重要病理特征. 臨床研究證實，黏液高分泌病史是肺功能第1秒用力呼氣量（FEV1）下降加速的獨立危險因素. 在哮喘病情加重過程中，這種過度分泌而導致的氣道阻塞尤為突出，常成為重癥哮喘的主要死因之一. 由于杯狀細胞產生黏蛋白的機制尚未完全弄清，目前臨床沒有針對性藥物. 近年來，IL9， IL4， IL13等Th2細胞因子等外界因素以及杯狀細胞自身表皮生長因子受體（EGFR）、凋亡抑制蛋白Bcl2等對粘蛋白產生的促進作用，先后得到證實［7］. 尤其引人注目的是杯狀細胞CLCA與黏蛋白分泌的關系. 2001年Nakanishi等［3］首先利用正義和反義RNA技術證明，小鼠氣道杯狀細胞鈣激活Cl通道Ⅲ型（mCLCA3）高表達，是致敏哮喘小鼠粘液高分泌的關鍵環節. 而正常小鼠mCLCA3表達量極低. 次年Hoshino等［4］報道mCLCA3的異種同源蛋白hCLCA1在哮喘患者杯狀細胞高表達，是正常人群的近3倍. Toda等［5］的結果還表明，杯狀細胞hCLCA1 mRNA與IL9R兩者的陽性率密切相關，提示hCLCA1與其他促分泌因素有著內在聯系. 因此，進一步通過離體實驗證實hCLCA1與杯狀細胞黏蛋白產生的因果關系，將為通過阻斷CLCA來控制氣道黏液高分泌提供理論依據. 我們首先證實在NCIH292細胞未能檢測到hCLCA1 mRNA. 利用基因工程技術，成功地將帶有hCLCA1基因的真核表達載體導入NCIH292細胞. 從標簽蛋白的表達、hCLCA1的轉錄兩方面證實篩選出NCIH292/hCLCA1穩定轉染的細胞. 在此基礎上，MTT法結果顯示NCIH292/hCLCA1細胞的增殖活性高于親本細胞.

PAS特染及RTPCR法檢測表明，NCIH292/hCLCA1細胞中黏蛋白MUC5AC的含量顯著高于親本細胞. 這與在體研究結果相一致［3］. 而CLCA通道阻斷劑NFA有效減低了NCIH292/hCLCA1細胞的高增殖活性、黏蛋白高表達. 正反兩方面均證實hCLCA1對粘蛋白合成具有促進作用. 這可能與CLCA對胞內高Ca2＋的維持有著正反饋效應有關［8］. 還需深入研究的是CLCA的胞內信號轉導機制及與其他促進因素的關系.

參考文獻

［1］ Fahy JY. Goblet cell and mucin gene abnormalities in asthma ［J］. Chest， 2002; 122(6 Suppl): S320-326.

［2］ Zuhdi AM， Piazza FM， Selby DM， et al. Muc5/5ac mucin messenger RNA and protein expression is a marker of goblet cell metaplasia in murine airways ［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2000; 22: 253-260.

［3］ Nakanishi A， Morita S， Iwashita H， et al. Role of gob5 in mucus overproduction and airway hyperresponsiveness in asthma ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2001; 98(9): 5175-5180.

［4］ Hoshino M， Morita S， Iwashita H， et al. Increased expression of the Human Ca2+activated Cl Channel 1 (CaCC1) gene in the asthmatic airway ［J］. Am J Respir Crit Care Med， 2002; 165(8): 1132-1136.

［5］ Toda M， Tulic MK， Levitt RC， et al. A calciumactivated chloride channel (HCLCA1) is strongly related to IL9 expression and mucus production in bronchial epithelium of patients with asthma ［J］. J Allergy Clin Immunol， 2002; 109(2): 246-250.

［6］ Shao MX， Ueki IF， Nadel JA. Tumor necrosis factor alphaconverting enzyme mediates MUC5AC mucin expression in cultured human airway epithelial cells ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2003; 100(20): 11618-11623.