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1方法

1．1細胞培養GES－1細胞株用DMEM培養液(10%胎牛血清，1%P/S雙抗，1%HEPES緩沖液)進行培養;BGC－823和SGC－7901用RPMI－1640培養液(10%胎牛血清，1%P/S雙抗，1%HEPES緩沖液)進行培養，在合適的濕度、5%CO2、37℃環境下行無菌培養。當細胞富集度達到75%左右，用0．25%的胰酶消化成單個細胞，進行傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1．2MTT對細胞增殖的檢測將對數生長期的GES－1、BGC－823、SGC－7901細胞計數后以規定密度(4×104/mL)均勻接種于24孔(每孔500μL)培養板中，每組設4個復孔。培養24h，待細胞充分貼壁后，將培養液分別更換為含0、0．0001、0．01、1、10、100mmol/L的SNP培養液，繼續培養12、24、48、72h后，加入MTT(5g/L)溶液30μL，繼續培養4h，之后加入400μLFormazan溶解液過夜溶解，待紫色物質完全溶解后在酶標儀波長570nm處檢測，實驗重復3次。

1．3NO測試盒對NO濃度檢測加入MTT之前，每孔取出100μL培養液放入1．5mL離心管內，加入NO測試盒內的試劑一200μL，混勻，再加入試劑二100μL，充分渦旋振蕩后放置10min，然后離心(4000r/min)15min。取上清液160μL加入96孔板中，按試劑三:試劑四:試劑五為2．5:1:1的比例配成染色劑，在取出的上清液中每孔加入80μL，混勻，放置15min后在酶標儀波長550nm處檢測并計算NO濃度。

1．4統計學分析實驗數據為計量資料，均以mean±SD描述，多組間均數比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD，運用SPSS19．0統計軟件進行統計學分析，檢驗水準α=0．05，P＜0．05表示差異有統計學意義。

2結果

2．1外源性NO對胃癌細胞BGC－823增殖的影響MTT檢測結果表明，胃癌細胞株BGC－823在12、24、48、72h加入不同濃度SNP后，與對照組相比，胃癌細胞的增殖受到明顯的抑制，且隨著SNP濃度的增高其抑制作用逐漸增強(圖1)。其中對0．0001mm/L濃度組和0．01mm/L濃度組對細胞增殖的抑制作用在12、24、48h組與對照組相比差異無統計學意義，而0．01mm/L濃度組在72h時與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0．01)，10mm/L濃度組與100mm/L濃度組相比差異無統計學意義。

2．2外源性NO對胃癌細胞SGC－7901增殖的影響MTT結果表明，胃癌細胞株SGC－7901在12、24、48、72h加入不同濃度SNP后，與對照組相比，胃癌細胞的增殖受到明顯的抑制，且隨著SNP濃度的增高其抑制作用逐漸增強(圖2)。其中0．01mm/L、1mm/L濃度組、10mm/L濃度組、100mm/L濃度組在12、48、72h時對細胞的增殖作用與對照組相比差異有統計學意義(P＜0．01)，而0．01mm/L濃度組在24h時與對照組相比差異無統計學意義(P＞0．05)。

2．3外源性NO對正常胃粘膜細胞株GES－1增殖的影響MTT結果顯示，正常胃粘膜細胞株GES－1在12、24、48、72h加入不同濃度SNP后，與對照組相比，細胞的增殖受到明顯抑制，且隨著SNP濃度的增高其抑制作用逐漸增強(圖3)。其中0．0001mm/L濃度組、0．01mm/L濃度組和1mm/L濃度組在12h時對細胞的增殖作用與對照組相比差異無統計學意義(P＞0．05)，而在24h0．0001mm/L濃度組(P=0．00)、0．01mm/L濃度組(P=0．00)、1mm/L濃度組(P=0．00)與對照組相比，差異有統計學意義。在48h和72h0．0001mm/L濃度組與對照組相比差異無統計學意義，其他濃度組對細胞增殖都有抑制作用。

2．4不同濃度SNP處理BGC－823胃癌細胞后培養液中NO濃度的檢測運用NO濃度檢測試劑盒，檢測酶標儀波長550nm處吸收值并計算NO濃度。結果表明，培養液中NO濃度隨著SNP濃度的增高而增高。

2．5不同濃度SNP處理胃癌細胞SGC－7901后培養液中NO濃度的檢測運用N0測試盒，檢測酶標儀波長550nm處吸收值并計算NO濃度，結果表明，培養液中NO濃度隨著SNP濃度的增高而增高。

2．6不同濃度SNP處理正常胃粘膜細胞GES－1后培養液中NO濃度的檢測運用NO測試盒，檢測酶標儀波長550nm處吸收值并計算NO濃度。結果表明，培養液中NO濃度隨著SNP濃度的增高而增高。

3討論

研究表明，通過基因敲除技術將一氧化氮合成酶敲除后，小鼠因一氧化氮合成酶表達缺失而在胚胎時期死亡。NO合成酶的每個異構體在不同組織選擇性發揮不同生物學功能。如eNOS基因敲除小鼠表現出嚴重的高血壓，主要是因為特定表達的上皮細胞中的eNOS在血管形成、增殖中起重要作用。而iNOS缺乏的小鼠容易感染疾病，且在巨噬細胞抵御病原體與腫瘤細胞侵襲中顯得功能異常。nNOS基因表達異常容易導致神經系統發育及信息傳遞方面的缺陷。可見一氧化氮合成酶的正常表達與機體生理和病理學功能正常實現有密切聯系。但是一氧化氮在細胞功能學方面的作用一直未能徹底闡明，且有些結論相互矛盾。如有研究表明，外源性供體產生的NO對細胞有毒性作用，容易誘導細胞進入凋亡。但是也有結果顯示，NO可能對細胞起保護作用。如腫瘤細胞獲得性表達iNOS后，在體外實驗中發現其可誘導免疫細胞進入凋亡，或許這也是其逃避免疫系統監督的機制之一。本研究利用SNP供體研究外源性NO對兩株胃癌細胞及正常胃粘膜細胞增殖的影響。結果顯示，外源性NO對正常胃粘膜細胞和胃癌細胞均有抑制作用(P＜0．05)，且隨著NO濃度的增高其抑制作用逐漸增強。綜上所述，外源性NO對正常胃粘膜細胞和胃癌細胞的增殖具有抑制作用。

作者：解亞麗喬金婉于冬悅趙婧劉永年楊生璽蘇占海單位：青海大學研究生院中國藥科大學青海大學醫學院基礎醫學部