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【摘要】目的地西他濱具有較好的抗腫瘤活性，其分子機制與DNA去甲基化有關，本研究通過DAC對腺瘤性結腸息肉病基因的表達水平和去甲基化的影響，探討DAC誘導宮頸腺癌Hela細胞凋亡分子機制。方法不同濃度的DAC作用于宮頸腺癌Hela細胞24、36和48h，MTT法檢測對宮頸癌細胞的增殖抑制作用，觀察DAC對Hela細胞增殖的濃度依賴效應和時間依賴效應。流式細胞術檢測DAC對宮頸腺癌Hela細胞凋亡和細胞周期的影響。在DAC作用于宮頸腺癌Hela細胞前后，通過甲基化特異性PCR檢測APC基因的甲基化狀態；RT－PCR法檢測APC基因mRNA表達水平；蛋白質印跡法檢測APC蛋白、β－catenin蛋白在胞內及核內表達的變化。結果DAC對宮頸腺癌Hela細胞增殖抑制具有濃度依賴效應和時間依賴效應，Hela細胞半數抑制濃度（IC50）24、36、48h分別為28．23、7．65和5．64μmol／L。DAC處理后的宮頸腺癌Hela細胞的凋亡率為（73．82±0．11）％，明顯高于對照組的（12．41±0．24）％，P＜0．001。DAC處理Hela細胞后，S期細胞比例（47．82±2．57）％和G2期細胞比例（30．87±2．28）％顯著高于空白對照組的S期細胞比例（24．08±0．71）％和G2期細胞比例（2．52±0．84）％，P＜0．001。DAC處理后，APC基因啟動子區域去甲基化狀態明顯增高，APCmRNA表達量上升，處理前后比較差異有統計學意義，P＜0．05。DAC處理后，胞內APC蛋白表達上調，而胞內和核內的β－catenin蛋白表達下調，差異均有統計學意義，P＜0．05。結論DAC可通過對APC基因的去甲基化作用，上調胞內APC蛋白表達，下調胞內和核內β－catenin表達，誘導宮頸癌細胞凋亡。

【關鍵詞】地西他濱；Hela細胞；甲基化；凋亡；宮頸癌

宮頸癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均較高。我國宮頸癌的發病率近年來呈年輕化的趨勢，嚴重威脅著女性健康［1］。DNA甲基化是表觀遺傳學改變的主要分子機制之一，目前正受到科學家們的高度重視和關注［2－3］。腺瘤性結腸息肉病基因甲基化水平上調導致的基因功能下調是宮頸腺癌發生的早期事件，具有早期診斷的敏感性和特異性，在腫瘤發生、發展的全過程中穩定存在［4］，通過抑制DNA甲基轉移酶活性，能夠阻斷異常APC基因的異常甲基化，導致APC蛋白活性恢復。地西他濱（decitabine，DAC）是目前臨床上常用抗癌藥物，也是常見的DNA甲基化轉移酶抑制劑之一［5］。臨床上，DAC對急性髓性白血病和慢性髓性白血病等均有明顯療效。DAC用于宮頸癌的治療目前鮮見報道，本研究從分子水平探討DAC對宮頸癌的作用機制，為今后臨床應用治療宮頸腺癌提供新的思路和實驗室依據，也可為宮頸腺癌的分子靶向治療提供理論依據。

1材料與方法

1．1主要試劑

DAC購自美國Sigma公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物公司，鼠抗人APC單克隆抗體購自美國RD公司，PCR試劑盒購自上海生工公司。

1．2細胞培養宮頸腺癌

Hela細胞，用含10％FBS的1640培養基培養，置于溫度37℃、5％CO2、相對濕度為90％的恒溫培養箱中，進行培養。

1．3MTT檢測

用0．25％的胰酶消化并收集生長狀態良好的宮頸腺癌Hela細胞（保證細胞處于單細胞懸浮狀態），將細胞調整到約104個／孔的密度鋪種于96孔板，每孔體積約200μL，37℃、5％CO2培養箱內培養過夜；待細胞密度生長至80％以上時（一般培養過夜后），加處理因素。設空白對照組和DAC處理組，處理組藥物濃度設為0．1、1、10和20μmol／L4個濃度，每組設4個復孔。在培養24、36、48h時加入MTT液20μL／孔，繼續培養4h后，將上清液輕輕吸凈，再加入DMSO200μL／孔，予振蕩搖勻10min，待結晶溶解后。酶標儀設定檢測A為570nm，測出各孔的吸光度，計算抑制率，并繪制出不同細胞系的生長曲線。

1．4流式細胞術檢測細胞周期及凋亡

將人宮頸腺癌Hela細胞調整為2×105mL－1，接種在6孔無菌培養板中，每個孔共4mL，Hela細胞DAC的最終濃度為10μmol／L，每組均設復孔3個，設不加藥對照孔。置于37℃、5％CO2飽和濕度條件的培養箱內，培養36h后，收集細胞以進行染色，流式細胞儀測定。

1．5MSP檢測APC基因甲基化狀況

首先按試劑說明書提取DNA，置于－20℃保存。紫外分光光度計檢測DNA濃度。DNA濃度計算為A260×200×50μg／mL。鑒定DNA純度可通過計算A260／A280比值。MSP檢測主要步驟如下：（1）DNA亞硫酸鹽修飾：充分振蕩進行混勻后，室溫下孵育約5～10min。

（2）重懸DNA：4℃，1000r／min，離心1min（r＝15cm），棄上清，離心管底部可見一小塊白色沉淀物即為DNA，加1mL的70％乙醇之后振蕩，4℃，500r／min，離心1min（r＝15cm），棄上清。每個樣本中均加入30μL的TE緩沖液溶解，快速強力振蕩，直到沉淀完全重懸，置于50～60℃水浴15min，以使DNA完全溶解，高速離心2～3min后，用吸管吸取上清液到一個新的微量離心管中，繼續進行MSP檢測或儲存于－20℃（可保存≥2個月）或－80℃（可保存6個月以上）備用。

（3）設計APC甲基化和非甲基化引物，一組是甲基化引物（M），一組是非甲基化引物（U），引物序列APC－M上游引物為5′－GGTATATT－TTCGAGGGGTACG－3′，下游引物為5′－TTCCCGA－CCCGCACTCCGC－3′，退火溫度56℃，擴增片段為90bp；APC－U上游引物為5′－TGTGAGGGTATAT－TTTTGAGGGGTAT－3′，下游引物為5′－CTTCTCT－CTCCACTTCCCAACCCA－3′，退火溫度56℃，擴增片段為109bp。

（4）MSP反應：PCR反應液：在冰浴條件下配制反應體系25μL，將下列各成分加入到0．2mL的無菌EP管中：10×TaqBuffer2．5μL，TaqHotstart0．15μL，dNTP2．0μL，上引物1μL，下引物1μL，DNA3μL，TaqDNA聚合酶（1U／μL）1μL，H2O補足25μL。PCR反應條件：95℃5min，95℃45s，56℃45s，72℃45s，40個循環；72℃延伸7min，10℃結束反應，各PCR產物－20℃冰箱保存。

（5）電泳及結果判斷：8μL的PCR產物中，加入1．5μL的電泳上樣緩沖液，進行充分地混勻，加樣于2．5％的瓊脂糖凝膠上，進行電泳，設定電壓為88V，電泳40min后，通過凝膠圖像分析系統進行觀察并保存結果。

（6）陽性的結果判斷：擴增后，如果甲基化產物中有目的條帶，而非甲基化產物中沒有目的條帶，則說明APC發生了甲基化，如果在非甲基化產物中出現目的條帶，而在甲基化產物中不出現目的條帶；則說明基因未發生甲基化，如果APC－甲基化引物和APC－非甲基化引物擴增時，同時出現了擴增條帶，則說明APC發生了不完全甲基化。

1．6RT－PCR檢測

APC上游引物為5′－GTCCCTCCGTTCTTATG－GAA－3′，下游引物為5′－GGCTATTCTTCGCTGTG－CTC－3′，擴增片段385bp。β－actin上游引物為5′－G－GACCTGACTGACTACCTC－3′，下游引物為5′－CA－TACTCCTGCTTGCTGAT－3′，擴增片段553bp。cDNA逆轉錄按說明書上步驟進行操作：按20μL體積進行配制，在冰上操作，反應體系如下：5×ReveresBuffer4μL，10mmoldNTP2μL，RNA酶抑制劑0．5μL，AMV逆轉錄酶0．5μL，Oligo（dT）18引物1μL，TotalRNA2μg，加入無RNA酶水，定容至20μL，55℃30min，85℃5min，冰上終止反應。PCR擴增，體系如下：2×TaqMasterMix10μL，上游引物10μmol／L1μL，下游引物10μmol／L1μL，cD－NA2μL，Rnase－FreeWater定容至25μL。PCR儀上65℃孵育5min，然后置冰上冷卻。PCR反應條件：預變性94℃5min，變性94℃30s，53℃30s，55℃40s，72℃30s，72℃7min，4℃冷卻，35個循環。取5μLPCR產物進行凝膠電泳，以DL－Mark2000作為指示，恒壓100V電泳30min左右。凝膠成像后分析灰度值，計算目的基因的表達量。

1．7蛋白質印跡法檢測

（1）分別收集DAC處理36h的Hela細胞5×106個細胞，按提取試劑盒步驟分別提取總蛋白與核蛋白。立即使用，或－70℃凍存。BCA蛋白濃度測定法分別取總蛋白和核蛋白測定濃度。

（2）蛋白質變性：加SDS上樣并緩沖液混勻，沸水煮5min后，冰上放置2min，－80°C保存備用。

（3）SDS－PAGE電泳：80V電泳約30min，再100V電泳溴酚藍跑到底時終止電泳，進行轉膜。

（4）轉膜：濕轉法，100V恒壓90min。

（5）封閉、孵育抗體：5％脫脂奶粉封閉之后，予5％BSA稀釋一抗，4℃，搖床過夜。用5％脫脂奶粉稀釋二抗，室溫脫色搖床上搖動1．5h。

（5）化學發光、顯影、定影及分析，灰度掃描。

1．8統計學方法實驗所得數據采用SPSS18．0分析，以x－±s表示，兩兩比較采用χ2檢驗，多組之間采用非參數K檢驗。檢驗水準α＝0．05。

2結果

2．1對宮頸腺癌Hela細胞生長抑制作用

MTT法檢測結果顯示，當DAC處理后，不同時間點上，細胞的抑制率隨著DAC濃度的增加（0．1、1、10和20μmol／L）呈上升趨勢，高濃度（20μmol／L）對細胞的增殖抑制最明顯。說明DAC對宮頸腺癌Hela細胞的生長抑制有濃度依賴效應。不同時間點DAC處理后各組之間的Hela細胞抑制率比較差異有統計學意，P＜0．001。DAC對宮頸腺癌Hela細胞的生長抑制有時間依賴效應。細胞半數抑制濃度（IC50）24、36、48h分別為28．23、7．65和5．64μmol／L。根據不同濃度不同時間所得的IC50值，在后續實驗中選擇最佳濃度為10μmol／L，最佳處理時間36h。

2．2對宮頸腺癌Hela細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果如圖2顯示，DAC處理后宮頸腺癌Hela細胞的凋亡率為（73．82±0．11）％，明顯高于對照組的（12．41±0．24）％，兩者比較差異有統計學意，P＜0．001。

2．3對宮頸腺癌Hela細胞細胞周期的影響

DAC處理Hela細胞后，S期細胞比例（47．82±2．57）％和G2期細胞比例（30．87±2．28）％明顯高于空白對照組的S期細胞比例（24．08±0．71）％和G2期細胞比例（2．52±0．84）％，處理前后比較，S期和G2期細胞比例差異均有統計學意義，P＜0．001；表明DAC主要阻滯宮頸腺癌Hela細胞于S期和G2期。

2．4對APC基因甲基化的影響

MSP法檢測DAC處理前后Hela細胞的甲基化狀態，發現Hela細胞株中存在APC基因啟動子區的高甲基化，經過DAC處理之后出現較明顯非甲基化條帶，表現部分甲基化狀態，甲基化擴增產物出現減少，非甲基化擴增產物增多（圖3）。表明DAC可以明顯逆轉Hela細胞株APC基因甲基化狀態。

2．5對APCmRNA表達影響

無DAC干預的情況下，APC基因的表達量低；DAC處理后APC基因mRNA的表達水平明顯升高，處理前APCmRNA的相對表達量為0．823±0．21，處理后相對表達量為0．279±0．17，兩樣本比較差異有統計學意義，P＜0．001（圖4）。表明DAC可促進APCmRNA的表達。注：Marker．DNA標記；U．非甲基化引物擴增后DNA條帶；M．甲基化引物擴增后DNA條帶圖3地西他濱處理前后Hela細胞中APC基因的甲基化狀態圖4RT－PCR檢測地西他濱對宮頸癌Hela細胞APCmRNA表達的影響

2．6APC蛋白和β－catenin蛋白的表達

DAC處理組APC蛋白相對表達量為1．542±0．053，未處理組胞內相對表達量為0．780±0．021；未處理組胞內β－catenin蛋白相對表達量為0．890±0．032，DAC處理組相對表達量為0．354±0．015；DAC處理組中APC蛋白表達水平增加，β－catenin蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義，P＜0．001（圖5）。說明DAC促進胞內APC蛋白表達，抑制β－catenin蛋白表達。由于APC蛋白在核內不表達，所以僅檢測核蛋白中β－catenin蛋白在DAC干預前后的表達情況，結果顯示，空白對照組核內β－catenin蛋白相對表達量為0．632±0．036，高于實驗組相對表達量的0．336±0．013，差異均有統計學意義，P＜0．001。說明DAC抑制核內β－catenin蛋白表達。

3討論

宮頸癌的發生發展與表觀遺傳學異常有很大的聯系，人們普遍認為引起宮頸癌的一個重要原因是腫瘤相關基因啟動子區域CpG島的高甲基化［5］。有研究發現，DNA啟動子發生甲基化后，可影響基因轉錄過程中的模板DNA鏈與RNA聚合酶的結合，降低基因的轉錄活性，抑制抑癌基因的表達，引起腫瘤細胞的異常增殖，與惡性腫瘤的發生發展密切相關［6］。DNA甲基化是許多抑癌基因功能失活的機制之一，且在某些情況下，甚至是許多抑癌基因功能失活的唯一方式，越來越多的研究發現，DNA甲基化參與了癌癥啟動過程和進展［2－3］。由于DNA甲基化具有可逆性的特點，表達沉默的抑癌基因、DNA損傷修復基因、細胞周期調控基因以及信號通路中的某些關鍵調控因子等出現異常甲基化后，可以在DNA甲基化抑制劑的作用下逆轉而發生去甲基化，可恢復抑癌基因的活性從而抑制腫瘤的生長，這對于抗腫瘤治療來說是十分有意義的。

APC基因是在Wnt／β－catenin信號轉導通路中的重要抑癌基因，研究發現，APC基因啟動子的高甲基化及基因轉錄缺失見于多種腫瘤，也是與宮頸腺癌發生密切相關的抑癌基因［7－9］。APC基因甲基化水平的上調導致的基因功能下調是宮頸腺癌發生的早期事件，具有早期診斷的敏感性和特異性，在腫瘤發生、發展的全過程中穩定存在［10］，APC蛋白與β－catenin結合時，能夠促進β－catenin的絲氨酸和蘇氨酸殘基發生磷酸化，繼而β－catenin在蛋白酶體中發生降解。若APC蛋白出現缺失，則無法與β－catenin蛋白結合，胞質中積累的β－catenin通過轉位進入到細胞核中，與Tcf－4結合形成復合體，啟動增殖相關基因（如c－myc，CyclinD1）的轉錄，導致腫瘤細胞的生長失控［11］。有研究發現，APC甲基化水平與宮頸癌發生發展相關，宮頸癌組APC基因甲基化率56．8％明顯高于正常對照組的10％；APC甲基化陽性率隨腫塊增大及淋巴結轉移而增高；且與不同宮頸癌病理類型相關［12］。DAC是目前臨床上常用抗癌藥物，也是常見的DNA甲基化轉移酶抑制劑之一，屬于脫氧胞苷酸的腺苷類似物。DAC使已經發生高度甲基化的基因發生去甲基化改變，并激活沉默失活的基因，使得抑癌基因功能活化，促凋亡分子表達水平的增高，從而抑制腫瘤細胞生長［13］。

DAC能夠逆轉多種實體瘤的惡性生物學行為，但目前并不清楚它對宮頸腺癌細胞是否也有類似的作用。本研究發現，DAC對宮頸腺癌Hela細胞的生長抑制有時間依賴和濃度依賴效應；DAC能顯著誘導宮頸腺癌Hela細胞凋亡，且主要阻滯在細胞周期的S期和G2期，表明DAC促進宮頸腺癌Hela細胞凋亡是由于能影響細胞的分裂和DNA后期的合成。DAC誘導APC去甲基化主要是通過該基因5’端啟動子區CpG島去甲基化而實現，在本研究中，未經DAC處理的宮頸腺癌Hela細胞，其APC基因出現高甲基化。而使用去甲基化藥物DAC處理后，Hela細胞的APC基因出現了較明顯的去甲基化，這表明DAC對Hela細胞中的APC基因有去甲基化作用。進一步采用RT－PCR方法檢測APCmRNA的表達，結果顯示，DAC處理后甲基化水平下調，而APCmRNA的表達量明顯增加，說明了在DAC能夠使APC基因5’端啟動子區CpG島發生去甲基化，恢復APC基因的活性，導致APC基因的mRNA和蛋白表達均上調。DAC可通過對APC基因的去甲基化作用，誘導宮頸腺癌Hela細胞凋亡。DAC處理后APC蛋白明顯增加，β－catenin蛋白明顯減少，有助于抑制腫瘤生長。APC蛋白與β－catenin蛋白均為Wnt／β－catenin信號轉導通路中重要的物質，此結果說明DAC作用于宮頸腺癌Hela細胞后，Wnt／β－catenin信號轉導通路產物量減少，促進細胞凋亡，抑制腫瘤生長。說明DAC可通過下調胞內和核內β－catenin表達抑制Wnt／β－catenin信號通路，誘導宮頸腺癌Hela細胞凋亡?？傊?，DAC誘導APC基因去甲基化可能是通過抑制WNT信號通路并促進宮頸癌細胞凋亡，從而達到治療腫瘤的目的，為特異性甲基化酶抑制劑應用于臨床治療提供了有用理論依據和實驗基礎。

參考文獻

［1］李雪，孔為民，韓超，等．首都醫科大學附屬北京婦產醫院1992－2011年間宮頸癌發病趨勢分析［J］．中華婦幼臨床醫學雜志，2013，9（3）：310－314．

［4］王宏，潘世揚，龐智睿，等．子宮頸癌和CIN患者血漿APC和RASSF1A基因啟動子甲基化檢測的意義［J］．中華婦產科雜志，2013，48（12）：929－934．

［12］陳勇，陳雙鄖，張春蓮，等．宮頸癌APC基因啟動子甲基化與其臨床病理特征的關系［J］．中國癌癥雜志，2009，19（10）：755－760．

作者：宋汶珂；唐彩霞；黃彤輝；孫曉紅 單位：南華大學附屬南華醫院婦產科