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【摘要】目的葡萄糖是維持腫瘤細(xì)胞存活的重要能量來(lái)源，有關(guān)研究表明低糖與無(wú)糖條件有可能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，成為潛在的腫瘤治療方式。本研究通過(guò)給予不同濃度葡萄糖刺激SKOV3與A2780卵巢癌細(xì)胞系，分析其細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡的改變，探討葡萄糖對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。方法在體外配制含不同葡萄糖濃度（0、2．5、5．5、25．0mmol／L）的培養(yǎng)基，分別模擬無(wú)糖、低血糖、正常血糖及高血糖水平的體內(nèi)環(huán)境，觀察不同葡萄糖濃度對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡與細(xì)胞周期的影響。結(jié)果高糖促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780的增殖，干預(yù)48h后，增殖幅度約為無(wú)糖組的1．841～1．942倍；低糖與無(wú)糖條件誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，與高糖組相比，SKOV3細(xì)胞G1期比例以（40．699±1．131）％增加至（58．619±2．643）％，A2780細(xì)胞以（46．348±2．150）％增加至（54．770±2．475）％；低糖與無(wú)糖條件亦誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，SKOV3與A2780細(xì)胞無(wú)糖組中凋亡細(xì)胞比例分別為（14．015±0．827）％和（12．930±1．127）％。結(jié)論本研究通過(guò)探討葡萄糖對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響，證明低糖與無(wú)糖條件誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯、細(xì)胞凋亡并抑制其生長(zhǎng)增殖。若進(jìn)一步給予相應(yīng)葡萄糖抑制劑干預(yù)，可能為卵巢癌的臨床治療提供新思路。

【關(guān)鍵詞】卵巢癌；葡萄糖；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

目前，卵巢癌是婦科惡性腫瘤中引發(fā)患者死亡的主要原因［1］，約75％的卵巢癌患者在確診時(shí)已處于疾病晚期階段，該類患者在確診時(shí)多已伴有腫瘤局部侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等癥狀，常侵及子宮、肝臟、胸膜等器官，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。卵巢癌的基本治療方案通常包括分期手術(shù)或腫瘤減滅術(shù)，以及聯(lián)合鉑類藥物與紫杉醇的新輔助化療［2－3］。盡管該一線治療方案在短期內(nèi)治療效果尚可、可獲得較高反應(yīng)率，但大多數(shù)卵巢癌Ⅲ期或Ⅳ期患者經(jīng)治療后對(duì)化療藥物易產(chǎn)生抗藥性，其5年生存率＜40％［4－5］。因此，急需新的治療手段來(lái)改善卵巢癌患者的生存及預(yù)后情況。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2型糖尿病患者患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)增加［6］。此外，患有糖尿病的卵巢癌患者已被證實(shí)具有較低的存活率。另有研究證實(shí)，代表卵巢癌發(fā)生發(fā)展的早期（良性），中期及晚期（攻擊性與侵襲性）階段的小鼠卵巢表面的上皮細(xì)胞顯示越來(lái)越多的糖酵解表型。該表型證實(shí)了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與糖酵解途徑存在相關(guān)關(guān)系［7－8］。基于葡萄糖在卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用仍然知之甚少，本研究旨在測(cè)試葡萄糖對(duì)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。

1材料與方法

1．1細(xì)胞系

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3與A2780均由山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供。

1．2主要試劑與儀器RPMI

1640、DMEM／F12培養(yǎng)基以及胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，四甲基偶氮唑藍(lán)（methylthiazolyltetrazolium，MTT）、N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（N，N，N′，N′－Tetrameth－ylethylenediamine）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）購(gòu)自中國(guó)碧云天公司，AnnexinⅤ／FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。SpectraMaxi3型熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)MolecularDevices公司，F(xiàn)ACSCalibur型流式分析儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1．3方法

1．3．1實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)參考文獻(xiàn)［9］及預(yù)實(shí)驗(yàn)，選定0、2．5、5．5和25．0mmol／L葡萄糖濃度進(jìn)行分組，分別代表無(wú)糖、低血糖、正常血糖濃度及高血糖濃度的環(huán)境。

1．3．2人卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)

A2780細(xì)胞與SK－OV3細(xì)胞分別選用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％FBS的RPMI1640與含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％FBS的DMEM／F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的抗生素。將細(xì)胞轉(zhuǎn)至37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培育。

1．3．3MTT法細(xì)胞增殖檢測(cè)

分別選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SKOV3和A2780細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞特性不同，將每種細(xì)胞約4000個(gè)／孔接種在含有其相應(yīng)培養(yǎng)基的96孔板中。24h后，將細(xì)胞在對(duì)應(yīng)不同刺激條件的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48h。加入5μL／孔MTT溶液（5mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)1h后吸走孔內(nèi)液體，向每孔加入100μLDMSO終止MTT反應(yīng)。最終通過(guò)測(cè)定在570nm波長(zhǎng)下吸光度值檢測(cè)細(xì)胞活性。每個(gè)試驗(yàn)依據(jù)上述步驟至少重復(fù)3次。

1．3．4PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期

使用碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色法評(píng)估各組葡萄糖對(duì)SK－OV3與A2780細(xì)胞周期的作用，由20μg／mLPI＋200μg／mLRNaseA＋0．1％TritonX－100配制。以1．0×106mL－1鋪種到培養(yǎng)皿，過(guò)夜待細(xì)胞貼壁后，更換各組培養(yǎng)基。胰酶消化后使用冷PBS洗滌1～2次。室溫下1200r／min離心5min（r＝11．5cm），去除上層的液體，加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇5mL懸浮固定細(xì)胞，密封，4℃放置24～72h。固定后室溫下1200r／min離心5min（r＝11．5cm），去除上層液體。使用1mL預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗滌2遍后1200r／min離心5min（r＝11．5cm）并去除上清，加入一定量的PI（200～400μL）染液。使用流式細(xì)胞分析儀評(píng)估處于各個(gè)周期階段的細(xì)胞數(shù)。本試驗(yàn)依照上述步驟至少重復(fù)3次。

1．3．5細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用AnnexinⅤFITC試劑盒檢測(cè)AnnexinⅤ的表達(dá)。將細(xì)胞以1．0×106mL－1接種在培養(yǎng)皿中過(guò)夜培養(yǎng)，在上述糖濃度下培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞后用PBS洗滌，將細(xì)胞置于避光條件下置于含有AnnexinⅤ與PI雙染色溶液（0．1μgAnnexinⅤFITC＋1μgPI）的100μLbinding懸浮15min，并最終通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。本試驗(yàn)依照上述步驟至少重復(fù)3次。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用GraphpadPrism6．0對(duì)所有據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的分析，計(jì)量資料以x－±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。當(dāng)比較兩組之間的均數(shù)差異時(shí)，使用t檢驗(yàn)，當(dāng)≥3個(gè)樣本時(shí)，使用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。

2結(jié)果

2．1高糖促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖

根據(jù)上述糖濃度培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞48h，通過(guò)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖濃度增加，細(xì)胞增殖的相對(duì)百分比升高。SKOV3細(xì)胞高糖組較無(wú)糖組細(xì)胞增殖約（1．942±0．086）倍，t＝20．77，P＝0．0002；與低糖組比較，細(xì)胞增殖幅度自（1．161±0．117）倍變?yōu)椋?．942±0．086）倍，t＝7．949，P＝0．004；A2780細(xì)胞高糖組與無(wú)糖組相比，增殖約（1．841±0．157）倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4．193，P＝0．002），說(shuō)明低糖條件抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)，高糖條件促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

2．2低糖誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞G1阻滯

使用不同葡萄糖濃度培養(yǎng)細(xì)胞24h之后，與高糖組相比，低糖組細(xì)胞處于G0／G1期的百分比相對(duì)增多，隨著糖濃度減低，SKOV3細(xì)胞處于G0／G1的百分比依次為（40．699±1．131）％、（43．243±1．577）％、（44．846±1．768）％和（58．169±2．643）％，A2780細(xì)胞分別為（46．348±2．150）％、（50．875±8．598）％、（52．911±6．793）％和（54．770±2．475）％。SKOV3與A2780卵巢癌細(xì)胞高糖組（t＝8．888，P＝0．012）與無(wú)糖組（t＝5．358，P＝0．031）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2．3低糖誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡圖3示，采用AnnexinⅤ／PI法評(píng)估細(xì)胞凋亡數(shù)目，將細(xì)胞在上述糖濃度中培養(yǎng)24h，高糖組、正常糖組、低糖組與無(wú)糖組中，SKOV3細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例依次為（3．980±0．962）％、（6．618±0．632）％、（11．000±0．778）％和（14．015±0．827）％。低糖組與正常糖組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t＝7．013，P＝0．006；低糖組與高糖組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t＝8．027，P＝0．015。A2780細(xì)胞中發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例依次為（3．745±0．686）％、（4．490±0．198）％、（5．538±0．921）％和（12．930±1．127）％，無(wú)糖組與高糖組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t＝8．984，P＝0．012。

3討論

正常細(xì)胞癌變時(shí)，其葡萄糖代謝將從氧化磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為有氧糖酵解。腫瘤細(xì)胞通過(guò)新陳代謝提供其生長(zhǎng)與分裂所需的生物合成，并且維持其自身于較低水平的氧化（還原）穩(wěn)態(tài)。即使處于豐富的氧含量條件中，其能量產(chǎn)生優(yōu)先依賴于糖酵解。雖然糖酵解途徑中的三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）的凈產(chǎn)率不及氧化磷酸化途徑，但是腫瘤細(xì)胞通過(guò)提高葡萄糖攝取率這一特點(diǎn)，反過(guò)來(lái)促進(jìn)更高速率的糖酵解效應(yīng)進(jìn)行［10］。因此，腫瘤細(xì)胞具有更高的能量消耗比率，其生長(zhǎng)與合成對(duì)葡萄糖呈高度依賴性。本研究結(jié)果顯示，給予不同葡萄糖濃度培養(yǎng)48h后，隨著糖濃度增高，SKOV3與A2780卵巢癌細(xì)胞增殖為1．841～1．942倍，表明高葡萄糖濃度通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞產(chǎn)生ATP及其他生物前體的合成，為癌細(xì)胞生長(zhǎng)提供足夠的能量，從而快速促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖。

在低糖與無(wú)糖條件刺激下，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)凋亡、應(yīng)激以及細(xì)胞周期阻滯，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［11－12］。為進(jìn)一步探討低糖與無(wú)糖條件對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的影響，本研究通過(guò)體外設(shè)立4組葡萄糖濃度，模擬人體不同生理狀態(tài)的血糖水平［9］，結(jié)果顯示，通過(guò)對(duì)SKOV3與A2780卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行上述干預(yù)后，癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，阻礙了針對(duì)其細(xì)胞分裂所進(jìn)行的生物合成，如RNA、蛋白質(zhì)及其他生物前體，從而抑制細(xì)胞分裂、增殖。AnnexinⅤ作為一種磷脂結(jié)合蛋白，其通過(guò)磷脂酰絲氨酸與早期凋亡細(xì)胞的胞膜結(jié)合，故常作為檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞的靈敏指標(biāo)。

本研究中，在低糖或無(wú)糖條件刺激下，卵巢癌細(xì)胞凋亡比例為5．538％～14．015％，高糖組細(xì)胞凋亡比例為3．745％～3．980％，表明葡萄糖減低時(shí)，可能通過(guò)阻斷糖酵解導(dǎo)致ATP能量缺失而引發(fā)線粒體損傷，線粒體內(nèi)、外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔開放，釋放細(xì)胞凋亡啟動(dòng)因子，引發(fā)細(xì)胞凋亡。由此可以認(rèn)為，低糖或無(wú)糖刺激抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，可歸因于誘導(dǎo)其細(xì)胞周期G1期阻滯并卵巢癌細(xì)胞凋亡。綜上所述，本研究通過(guò)探討葡萄糖對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的影響，證明低糖與無(wú)糖條件誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯、細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。因此，若進(jìn)一步給予相應(yīng)抑制劑干預(yù)，有可能為卵巢癌的臨床治療提供新思路，這需要更深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

［12］謝澤君，唐玥，周靜，等．二甲雙胍聯(lián)合2－脫氧－D－葡萄糖對(duì)肝癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機(jī)制［J］．國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2017，44（2）：81－84．

作者：尹雅潔1，2;盛修貴2，3;王興武2，4;高楠1，2;王菲1，2;鄧祥云1，2 單位：1．濟(jì)南大學(xué)•山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院.醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，2.山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，3．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院婦瘤科，4．山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室