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作者：王寧王俐張慧君孫靜秋鄭衛東肖萍單位：上海市疾病預防控制中心毒理研究室

氟在地殼中的含量（以質量計）位于第13位，普遍分布于自然界。自1945年發現氟有防齲功效以來，氟化物已被廣泛用于飲水及口腔用品加氟預防齲齒，臨床上還用氟化物防治骨質疏松癥松癥，加之工業“三廢”排放造成的環境污染，人群暴露于氟的機會愈來愈多。適量的氟為機體所必需，但攝入過量的氟會使機體發生氟中毒。因此，有關氟的安全性問題引起了人們的關注，尤其是其潛在的細胞毒性和遺傳毒性。但由于各個實驗室之間的差異和試驗方法的敏感性不同，關于氟化鈉（sodiumfluoricle，NaF）是否引起DNA損傷以及引起損傷劑量的結論也不一致。筆者利用體外培養技術研究在不加入體外活化系統的條件下，NaF對大鼠軟骨細胞的增殖抑制作用及DNA損傷作用，以進一步揭示NaF的毒性作用機制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

恒溫氣浴搖床(日本Eyela公司)，CO2培養箱（美國Thermo公司），DMI3000B型倒置顯微鏡（德國Leica公司），PowerWaveXS型酶標分析儀（美國Bio-Tek公司），DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠），DYC34A型電泳槽（北京市六一儀器廠），BX51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。NaF（含量>99.9%，美國Sigma公司進口分裝），DMEM/F12培養液（美國Sigma公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），透明質酸酶、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶均購自美國Sigma公司，噻唑藍[溴化-3-(4，5-二甲基乙噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑，MTT]、Tris-HCl、Triton-100、正常熔點瓊脂糖（NMA）、低熔點瓊脂糖（LMA）均為美國Amresco公司進口分裝，二甲基亞砜（DMSO）、溴化乙錠（EB）均購自美國Sigma公司，Na2-EDTA（上海化學品試劑有限公司）。

1.2軟骨細胞的分離、制備

將2只2月齡SPF級雌性SD大鼠處死，在嚴格消毒的條件下，剪開膝關節，削取關節表面軟骨，放入盛有滅菌PBS的培養皿中，清除表面血污。用PBS沖洗數次后，將軟骨剪切為1mm3大小的碎塊，移入無菌培養皿內。加入4ml透明質酸酶，室溫孵育5min后倒去液體。再加入透明質酸酶4ml，再用PBS沖洗2次，移入離心管中。用10ml的胰酶37℃搖床消化30min，靜置5min，棄上清，用PBS洗2次。再用4mlⅡ型膠原酶37℃培養30min，去除上清液。最后再用4mlⅡ型膠原酶液37℃恒溫振蕩180min，收集上清液，以1000×g離心5min。用PBS清洗后加入DMEM/F12培養液（含10%胎牛血清），制成細胞懸液。

1.3方法

1.3.1MTT法參照文獻[4]，取對數生長期細胞以2×105個/孔接種于24孔培養板中，培養24h貼壁后，各染毒組用含NaF終濃度為0（陰性對照）、0.1、1.0、10.0、20.0、40.0mmol/L的培養基分別處理2、4、8、24h，同時設立空白對照（DMEM/F12培養液）組，每組均設3個平行孔。染毒結束后，加入MTT作用4h，再加入DMSO溶解藍紫色結晶物，在酶標儀上選擇570nm波長測定各孔吸光度（A）值，取均值，計算細胞存活率[細胞存活率=（染毒組A值-空白對照組A值）（/陰性對照A值-空白對照組A值）×100%]。

1.3.2單細胞凝膠電泳（SCGE）法取對數生長期細胞以2×105個/孔接種于24孔培養板中，培養24h貼壁后，用0（陰性對照）、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mmol/LNaF染毒4h，陽性對照組在紫外燈下照射10min。染毒結束后，制成單細胞懸液，按照Singh等的方法進行堿性單細胞凝膠電泳實驗。染色后在熒光顯微鏡下，每組隨機拍攝200個左右細胞，計算DNA損傷（拖尾）細胞率[DNA損傷（拖尾）細胞率=DNA損傷（拖尾）細胞數/細胞計數×100%]；并隨機選擇30個細胞，采用朱志良等研發的IMI1.0彗星分析軟件測定損傷細胞數、尾長、Olive尾矩、彗星矩。

1.4統計學方法

所有數據以x±s表示。采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析（OneWayANOVA）。進一步進行組間兩兩比較時，若方差齊時，采用SNK檢驗（Student-Newman-Keuls法）；若方差不齊時，采用Games-Howell檢驗。率間的比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1MTT法測定結果

倒置顯微鏡下觀察，陰性對照組和低濃度（0.1～1.0mmol/L）NaF染毒組細胞分裂旺盛，呈典型棱形或三角形；隨著NaF染毒濃度的增加和染毒時間的延長，細胞逐漸圓縮，折光性減弱，胞質中顆粒物增多；高劑量（40mmol/L）NaF染毒組大部分細胞脫落，漂浮于培養液中。不同濃度NaF染毒大鼠軟骨細胞不同時間后A值和存活率的變化見表1。與陰性對照組比較，染毒2h后20.0、40.0mmol/LNaF染毒組和染毒4、8、24h后10.0、20.0、40.0mmol/LNaF染毒組大鼠軟骨細胞的細胞活性均下降，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。且隨著NaF染毒濃度的升高，大鼠軟骨細胞的存活率呈下降趨勢。見表1。

2.2單細胞凝膠電泳結果

熒光顯微鏡下，陰性對照組細胞核呈圓形，少數細胞拖尾；陽性對照組幾乎100%拖尾，彗星細胞頭小而亮，彗尾較長。各染毒組絕大多數細胞都出現拖尾。隨著NaF染毒濃度的升高，彗星頭部變小，亮度增加；彗尾變長變圓，熒光強度增加。不同濃度NaF染毒大鼠軟骨細胞DNA損傷的變化見表2。表2可見，與陰性對照組相比，各濃度NaF染毒組大鼠軟骨細胞DNA損傷率均較高，差異有統計學意義（P<0.01）。且隨著NaF染毒濃度的升高，大鼠軟骨細胞DNA損傷率呈升高趨勢；但各濃度NaF染毒組細胞損傷率間比較，差異無統計學意義。不同濃度NaF染毒大鼠軟骨細胞尾長、Olive尾矩和彗星矩的變化見表3。表3可見，與陰性對照組相比，1.0～10.0mmol/LNaF染毒組大鼠軟骨細胞尾長、Olive尾矩和彗星矩較高，差異有統計學意義（P<0.01）。且隨著NaF染毒濃度的升高，大鼠軟骨細胞尾長、Olive尾矩和彗星矩均呈上升趨勢。

3討論

MTT實驗通過檢測線粒體中的琥珀酸脫氫酶可間接地反映活細胞數量。本實驗結果顯示，當NaF濃度較低（0.1～1.0mmol/L）時，細胞存活率沒有時間變化趨勢，與陰性對照組相比，細胞活性間差異無統計學意義。隨著染毒濃度的升高和染毒時間的延長，細胞存活率逐漸下降，說明NaF致大鼠軟骨細胞急性毒作用存在閾值。但是在NaF濃度較高時，細胞存活率下降減緩，且隨著作用時間的延長，這種趨勢更加明顯。表明NaF在本實驗濃度范圍內對大鼠軟骨細胞的毒性作用符合一般毒性效應規律。單細胞凝膠電泳又稱彗星試驗（cometassay），是近10年來發展十分迅速的檢驗細胞DNA損傷的新技術，筆者采用此技術檢測NaF對軟骨細胞DNA損傷的情況。MTT實驗結果顯示，10mmol/LNaF作用4h時，大鼠軟骨細胞存活率約為70%，而DNA已嚴重損傷。本實驗結果顯示，與陰性對照組比較，低濃度（0.1～1.0mmol/L）NaF染毒的大鼠軟骨細胞的細胞存活率約為93.33%~95.83%，差異均無統計學意義；而DNA損傷率已較高，約為81.41%～91.12%，差異均有統計學意義（P<0.01）；且大部分細胞開始出現拖尾，除1.0mmol/LNaF染毒組（P<0.01）外，0.1、0.5mmol/LNaF染毒組大鼠軟骨細胞的尾長、Olive尾矩和彗星矩雖較高，但差異無統計學意義。

本實驗結果還顯示，隨著NaF染毒濃度的增加（1.0～10.0mmol/L），細胞DNA損傷率繼續升高，與陰性對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.01）；但是尾長、Olive尾矩和彗星矩開始迅速增大，差異均有統計學意義（P<0.01）。這表明，此時細胞拖尾更加明顯，DNA損傷也更加嚴重。關于氟化物的遺傳毒性說法不一，多數學者認為氟可導致細胞核酸發生改變。體內研究表明，氟骨癥患者外周血淋巴細胞微核率及姐妹染色單體交換率（SCE）均高于對照人群，說明高氟可干擾DNA的穩定性，并影響細胞免疫。體外研究也揭示，NaF可引起培養的人成纖維細胞的DNA損傷和大鼠大腦神經細胞株（JHU-1）細胞的DNA單鏈的斷裂。但1988年，Tong等的研究表明，氟化物無遺傳毒性，僅影響細胞功能和酶活力。因此，筆者認為氟對遺傳基因的毒性作用盡管弱于一般的遺傳毒物，但高劑量、長時間作用可致細胞DNA發生損傷。氟致DNA損傷的作用機制有以下幾種推測：（1）干擾酶的活力和其他微量元素的代謝，引起DNA損傷。（2）氟化物作為外源性誘導物，引起復制DNA的斷裂，造成遺傳信息錯誤。（3）氟與尿嘧啶及酰胺有很強的親和力，含-NH-F基團的化合物可引起A-T堿基氫鍵斷裂，造成DNA、RNA結構改變，干擾它們的合成，增加DNA復制過程中堿基配對的錯誤頻率。不同濃度的NaF致DNA損傷的確切機制，有待進一步研究。