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作者：劉靜張金曉胡金芳申秀萍劉昌孝單位：天津藥物研究院天津中醫(yī)藥大學(xué)

隨著對基因組結(jié)構(gòu)和功能研究的深入及基因芯片技術(shù)的發(fā)展，基因芯片技術(shù)也逐漸應(yīng)用于研究藥物的毒性作用及其作用機制?；蛐酒夹g(shù)也被稱為dna微陣列（DNAarray），寡核苷酸微芯片（oligonucleotidemicrochip）或寡核苷酸微陣列（oligonucleotidemicroarray）。它利用大規(guī)模集成的手段將千百萬個DNA探針有規(guī)律地排列在固相支持物上，再將要研究的樣品DNA／RNA通過PCR擴增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，然后在芯片上與探針雜交，通過共聚焦顯微鏡或電光倍增管進行激光誘導(dǎo)熒光掃描，并配合計算機系統(tǒng)對每個探針上的熒光信號進行比較和定量分析，從而獲得樣品中大量基因序列及表達的信息。其最顯著的特點是高通量、高集成、多樣化和自動化。根據(jù)用途的不同，基因芯片分類為基因表達芯片和基因測序芯片。與藥物毒理學(xué)研究關(guān)系密切的為基因表達芯片。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，從新藥的篩選、毒理安全性評價到臨床應(yīng)用，基因芯片技術(shù)將成為貫穿整個藥物毒理學(xué)研究的重要技術(shù)。

1尋找毒性作用標(biāo)志物

安全性和有效性是藥物的兩大基本屬性，而藥物毒理學(xué)研究正是對藥物的安全性進行研究，以觀察藥物是否具有毒性作用及其可能的作用機制。傳統(tǒng)的毒理學(xué)實驗方法測定指標(biāo)針對性不強，反映的毒性靶點不確切，但基因芯片技術(shù)可以利用基因表達芯片，找出藥物作用于機體后的表達差異基因，再對不同類型的藥物所對應(yīng)的基因表達譜進行分類總結(jié)，找出其特征性的表達規(guī)律。這樣不同作用途徑的化合物都可以找到其特有的標(biāo)志基因。當(dāng)積累足夠多的基因表達圖譜數(shù)據(jù)，就可以建立毒物的毒理效應(yīng)數(shù)據(jù)庫。這樣，當(dāng)對毒性作用不清的藥物進行研究時，就可以將該藥物的基因表達圖譜與毒理效應(yīng)數(shù)據(jù)庫比對，從而找出其毒性作用靶點。特別是在藥物致癌性的研究中，利用基因組學(xué)技術(shù)，建立與致癌性相關(guān)的標(biāo)志基因數(shù)據(jù)庫，就能很快的探測新的藥物的致癌性，從而縮短致癌性研究周期。

Kazunari等利用基因芯片技術(shù)尋找致癌標(biāo)志基因，從而建立短期的藥物致癌性研究的生物鑒定系統(tǒng)。17種肝致癌性藥物、8種其他器官致癌性藥物及14種無致癌性藥物處理大鼠肝癌細(xì)胞MH1C13d，分析肝致癌性藥物及無致癌性藥物組間、致癌藥物及無致癌性藥物組間及肝致癌性藥物及其他致癌性藥物組間基因表達的變化，尋找到藥物肝致癌作用標(biāo)記基因。毒理學(xué)家通過尋找出來的某種特定毒性作用的標(biāo)志基因或生物標(biāo)志物將藥物進行分類，如有致癌性藥物和無致癌性藥物、有遺傳毒性和無遺傳毒性藥物、有肝毒性作用無腎毒性作用藥物和肝腎毒性均有的藥物等等，以便更好的對藥物的作用特點進行研究。vanDelft等分析了16種藥物的基因表達圖譜，找出具有遺傳毒性和不具有遺傳毒性的致癌藥物的表達差異基因，并驗證了6種致癌藥物有無遺傳毒性。在建立了毒性作用的標(biāo)記基因的基礎(chǔ)上通過進一步建立合適的生物模型系統(tǒng)，便可通過基因表達譜變化來反映藥物對人體的毒性。并且也可以將與毒性作用相關(guān)聯(lián)的差異表達基因編碼的功能蛋白作為毒性作用標(biāo)志物，用于監(jiān)控及指導(dǎo)臨床用藥。Sul等將大鼠分別暴露于正?？諝饧昂?×10−6、1×10−5的甲醛的空氣中，連續(xù)2周，每天6h，每周5d。取肺組織進行基因差異表達分析，研究發(fā)現(xiàn)21個表達差異的基因，其中上調(diào)基因2個，下調(diào)基因19個，其中羥甲基膽汁合酶、谷胱甘肽還原酶、碳酸苷酶2、利納肽受體3、跨膜酶體關(guān)聯(lián)蛋白5等9個基因被定量RT-PCR確定，希望能作為甲醛引起的人類相關(guān)病變的潛在生物標(biāo)記物。Rokushima等通過靜脈給予頭孢噻啶后分析Fischer344大鼠腎基因表達圖譜，找出具有時間、劑量依賴關(guān)系的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)腎損傷分子-1（kim-1）可以作為頭孢類抗菌素腎損傷的監(jiān)測指標(biāo)。

2藥物毒性作用機制

目前，明確藥物的毒性作用機制已經(jīng)成為新藥風(fēng)險評估的一個主要部分。采用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)對藥物進行毒理學(xué)研究，雖然能對藥物的部分毒理機制進行研究，但一次僅能檢測部分毒性作用產(chǎn)物的量、個別酶活性變化及個別基因表達變化，不能反映藥物整體的毒性作用。而基因芯片可同時檢測數(shù)千個基因?qū)λ幬锏姆磻?yīng)，具有一次檢測信息量大、快速、高效、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點，而且Waring和連冬生等發(fā)現(xiàn)具有相似毒性機制的化合物所獲得的基因表達譜具有相似性，因而，基因芯片技術(shù)技術(shù)逐漸成為研究藥物毒性作用機制的有效方法之一，在藥物毒理機制的研究中的應(yīng)用也越來越廣泛。

近年，具有肝毒性、腎毒性等常見毒性作用的藥物毒性機制研究較多，國內(nèi)外應(yīng)用基因組學(xué)技術(shù)進行藥物肝、腎毒性作用機制等研究也常有報道，形成了較為豐富的肝、腎毒性基因差異表達圖譜數(shù)據(jù)。Waring等和高利宏等均對肝、腎毒性基因差異表達圖譜數(shù)據(jù)進行聚類分析，根據(jù)不同的肝、腎毒性作用機制對藥物的基因表達圖譜進行分類，使新藥的肝、腎毒性作用機制研究更加確切。Akira等利用基因組學(xué)技術(shù)進行三氧化二砷（As2O3）腎毒性的作用機制研究，發(fā)現(xiàn)73個差異表達基因，通過分析，發(fā)現(xiàn)其腎毒性作用與HMOX1基因（編碼血紅素加氧酶）表達增加和活性氧族增加導(dǎo)致的細(xì)胞毒性有關(guān)，并且其細(xì)胞毒性作用可被α-類脂酸和活性氧族抑制劑等抑制。施暢等利用大鼠和人的全基因組芯片，分析Bay41-4109對大鼠肝臟和人肝細(xì)胞基因表達譜的影響，結(jié)果顯示引起大鼠肝臟發(fā)生差異表達的基因有41個，顯示Bay41-4109的肝毒性與藥物代謝酶表達異常以及脂肪能量代謝異常有關(guān)。而耳毒性、腦毒性、免疫毒性等毒性作用也有國內(nèi)外毒理學(xué)家進行研究，但報道相對較少。陳平等采用基因表達譜芯片對大劑量水楊酸鹽注射后的大鼠耳蝸和正常耳蝸進行基因差異表達分析，研究水楊酸鹽所致的耳聾和耳鳴等耳毒性的分子機制。結(jié)果顯示表達上調(diào)2倍以上的基因和表達序列標(biāo)簽（expressedsequencetags,ESTs）有42個，下調(diào)2倍以上的有49個。這些基因編碼通道蛋白、信號分子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子和各種酶類，也有許多功能未知基因，表明水楊酸鈉影響各種離子通道和突觸蛋白基因。洪巖等應(yīng)用基因芯片技術(shù)觀察As2O3對小鼠小腦組織氧化還原相關(guān)酶基因表達譜的影響。與對照組比較，染砷組中差異表達2倍以上的基因有18條，顯示As2O3對小鼠小腦的氧化還原相關(guān)酶基因表達譜具有明顯的影響，提示這些小腦氧化還原相關(guān)酶基因很可能是砷的神經(jīng)毒作用的靶點。目前，國外毒理學(xué)家也逐漸應(yīng)用基因組學(xué)技術(shù)進行遺傳毒性、致癌性等特殊毒性的作用機制研究。

3發(fā)現(xiàn)藥物潛在的毒性

對藥物進行毒性安全評價，是藥物篩選過程中十分重要的一個環(huán)節(jié)。目前藥物毒理學(xué)研究多通過大量的動物實驗來確定藥物的潛在毒性，這種方法測定指標(biāo)固定，需要依賴病理組織學(xué)檢查，毒性作用容易出現(xiàn)假陰性?；蛐酒夹g(shù)可將藥物毒性與基因表達特征聯(lián)系起來，通過基因表達分析確定藥物毒性，使得藥物毒性或不期望出現(xiàn)的效應(yīng)在臨床試驗前得以確認(rèn)。而且，基因芯片可以在一個實驗中同時對成千上萬個基因的表達情況進行分析，可以反映藥物對動物整體基因表達的影響，從而發(fā)現(xiàn)常規(guī)毒理試驗測定指標(biāo)中難以發(fā)現(xiàn)的毒性作用。在藥物的早期研發(fā)過程中，利用基因芯片技術(shù)對藥物的有效性及作用機制進行確認(rèn)時，由于基因芯片能反映機體整體基因?qū)λ幬锏膽?yīng)激作用，根據(jù)統(tǒng)計分析，找出有顯著差異表達的基因，分析其藥理作用相關(guān)基因及毒理作用相關(guān)基因，對于藥效劑量水平下藥物的潛在毒性也能發(fā)現(xiàn)。Kiela和楊義強等在研究印度齒葉乳香樹BoswelliaserrataRoxb的提取物時發(fā)現(xiàn)該藥高劑量不僅不改善腸炎的癥狀，而且利用基因芯片分析肝臟基因的表達譜時發(fā)現(xiàn)，高劑量組中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的大量基因表達失調(diào)，表明高劑量給藥時，該藥具有肝毒性。

在針對藥物某個特定的毒性作用進行機制研究時，利用基因芯片技術(shù)做基因表達分析，在發(fā)現(xiàn)該毒性的機制時，同樣也能發(fā)現(xiàn)該藥是否具有其他的潛在毒性作用，為進一步研究該藥的毒性作用指明方向。

4混合藥物中相互作用方式和機制

含有不同種類及比例的藥物混合可產(chǎn)生協(xié)同、相加或拮抗等毒性效應(yīng)。利用基因芯片技術(shù)可將在混合藥物作用下的基因表達改變與在單一毒物作用下的基因表達比較，觀察基因表達差異，其毒理效應(yīng)是否大于、小于或等于單一毒物的毒理效應(yīng)，并可以根據(jù)藥物混合產(chǎn)生的協(xié)同、相加或拮抗等毒性效應(yīng)來指導(dǎo)臨床用藥。藥物混合產(chǎn)生毒性作用協(xié)同或相加，則表明這種混合會增加藥物毒性，臨床應(yīng)禁止混合藥物中的聯(lián)合用藥；藥物混合產(chǎn)生毒性作用拮抗，則表明混合藥物中某種或幾種藥物對其中的具有毒性作用的藥物具有減毒作用，可以用來治療該藥物引起的毒性作用。Mandimika等研究了α-查茄堿、α-龍葵堿以及α-查茄堿–α-龍葵堿不同比例（2.8∶1、1.7∶1）對人腸細(xì)胞株Caco-2基因表達的影響，并結(jié)合乳酸脫氫酶（LDH）的變化，分析α-查茄堿、α-龍葵堿相互作用的關(guān)系及機制。

發(fā)現(xiàn)在α-查茄堿–α-龍葵堿為1.7∶1時具有協(xié)同作用。Kim等亦從基因表達譜的整體水平探討14種化合物及1種混合物對大腸桿菌基因表達的不同影響。

5進行高通量篩選新藥毒性

現(xiàn)在藥物毒性安全評價研究多通過嚙齒類、犬和猴等動物模型來確定藥物的潛在毒性，分為急性毒性試驗、長期毒性試驗、特殊毒性試驗、致癌性試驗等。急性毒性試驗僅能篩選出毒性作用較強的藥物，而長期毒性試驗、特殊毒性試驗、致癌性試驗等需要使用大劑量的藥物，試驗周期長、費用高，不利于新藥的前期篩選。而基因組學(xué)技術(shù)的高敏感、高信息量優(yōu)越性，使其在新藥篩選中的應(yīng)用越來越廣泛。利用基因芯片技術(shù)，從體外模型系統(tǒng)中，可以快速分析待測藥物對基因表達譜的影響，就能在藥物研發(fā)的早期階段很方便地鑒別出藥物的藥理作用及其毒理作用。這種方法用藥量少、周期短，可以同時對多種藥物進行分析，減少實驗動物的使用，從而節(jié)省動物、人力、財力、物力和時間。

Kazunari等用17種肝致癌性藥物、8種其他器官致癌性藥物及14種無致癌性藥物處理大鼠肝癌細(xì)胞MH1C1，基因表達圖譜分析，找到致癌標(biāo)志基因，從而建立短期的藥物致癌性研究的生物鑒定系統(tǒng)。并利用該系統(tǒng)進行了另外9種樣品的致癌性檢測，準(zhǔn)確率達到88.9%。

6毒性作用與基因多態(tài)性相關(guān)性研究

不同的物種，由于基因的不同，對同一藥物的反應(yīng)也不同。利用基因芯片技術(shù)可對單個或多個藥物進行分析，推斷藥物對不同生物的毒性可比性，找出敏感動物或敏感基因，并為將其作用外推到人提供依據(jù)。Sano等利用基因芯片技術(shù)，分析三氯乙烯誘導(dǎo)的肝毒性引起的基因表達變化在小鼠及大鼠之間的種屬差異，以便進一步研究三氯乙烯對人的肝毒性的作用與不同基因的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三氯乙烯對小鼠的TGF-β通路和蛋白激酶信號通路有影響，而對大鼠則無顯著性影響。在人類基因組中，平均每1000bp就有一個單核苷酸多態(tài)，若這種堿基的多態(tài)性出現(xiàn)在調(diào)控毒性反應(yīng)的基因上，將會影響個體對藥物的耐受性或易感性，甚至有少數(shù)人表現(xiàn)為對某些藥物毒性作用具有“高敏感性”。因此，基因的多態(tài)性與藥物毒性作用強度之間存在一定關(guān)聯(lián)。根據(jù)不同人群對同一藥物的反應(yīng)不同，利用基因芯片技術(shù)將人群快速分群，尋找對該藥物毒性作用敏感的基因。Komissarova等發(fā)現(xiàn)不同人提供的淋巴母細(xì)胞對亞砷酸鹽的毒性作用具有不同的敏感性，他們通過比較砷敏感的2種淋巴母細(xì)胞和砷抗性的兩種淋巴母細(xì)胞的基因表達圖譜，發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和人B細(xì)胞κ輕肽基因增強子核因子抑制因子ε（Nfkbie）在砷抗性的淋巴母細(xì)胞中表達增加，提示γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和Nfkbie可能可以作為砷遺傳敏感性的生物標(biāo)記物，并且這一方法同樣適用于別的藥物。

7提高藥物研究的成功率

研究藥物的毒性作用與基因多態(tài)性的關(guān)系，能提高藥物研究的成功率，減少不必要的藥物淘汰。有些藥物雖然效果很好，但對一部分人不良反應(yīng)太大而不得不被淘汰。若是研究出該藥對某些基因組患者有效，而對另一些基因組患者無效或有不良反應(yīng)，然后在用藥前先對患者用基因芯片診斷，就能對一部分患者進行很好的治療，另一部分患者可以改用他藥。這樣該藥就會繼續(xù)發(fā)揮作用而不必被淘汰。而且利用基因芯片技術(shù)進行藥物基因組學(xué)的研究，根據(jù)遺傳差異對患者分型，從而進行新藥臨床試驗，能夠減少試驗人數(shù)而得到統(tǒng)計學(xué)結(jié)果，從而降低費用和時間。

8結(jié)語

在傳統(tǒng)的藥物毒理安全性評價研究中，采用常規(guī)動物模型的方法居多，動物選擇范圍有限，以大鼠、比格犬、猴居多，與人的遺傳背景差異較大，不能很好的反映藥物在人體上的作用；而且存在試驗周期長、藥物用量大、容易出現(xiàn)毒性作用假陰性等缺點。隨著分子生物技術(shù)水平的發(fā)展，藥物毒理學(xué)評價研究的方向逐步轉(zhuǎn)向使用遺傳背景與人更相似的動物，如轉(zhuǎn)基因動物；在基因水平、分子水平、細(xì)胞水平等不同層次研究藥物對機體的影響；對藥物進行早期、高通量的毒理篩選；增加測定指標(biāo)，重點進行藥物對心、肝、腎等主要器官的毒性早期觀測；尋找人類藥物不良反應(yīng)的關(guān)聯(lián)基因及關(guān)聯(lián)因素等方向，而基因芯片技術(shù)的成熟進一步推動了藥物毒理學(xué)研究的發(fā)展。

目前，利用基因芯片技術(shù)檢測藥物的潛在毒性作用、探索藥物毒性作用機制的研究較為廣泛，而利用基因芯片技術(shù)進行高通量的新藥毒理篩選、研究混合藥物的毒性機制、毒性作用與基因多態(tài)性相關(guān)性方面的研究才剛剛起步。隨著基因組學(xué)研究的深入，利用基因芯片技術(shù)將不同患者進行分群，藥物的毒性作用與特定基因間的關(guān)系也將被闡明，根據(jù)毒性作用的易感基因開發(fā)出用于特定基因人群的藥物并指導(dǎo)臨床患者用藥，將是藥物毒理學(xué)研究發(fā)展的趨勢。

然而，基因芯片技術(shù)還存在不少問題：①費用昂貴：相關(guān)儀器、試劑和芯片價格均較高；②背景干擾：在使用全核酸片段進行雜交時，應(yīng)考慮常見的背景干擾單個被檢核酸變異的問題；③重復(fù)性：不同的RNA提取方式會導(dǎo)致結(jié)果的不同，這給不同實驗室之間實驗數(shù)據(jù)的交流帶來困擾，因此每次試驗要求重復(fù)2～3次來證實最初的結(jié)果，為節(jié)約費用，建議用Norfilemblots或liT-PCR技術(shù)來驗證；④特異性和敏感性：在信號的獲取與分析上，當(dāng)前多數(shù)方法使用熒光法進行檢測和分析，重復(fù)性較好，但靈敏性仍然不高；⑤標(biāo)準(zhǔn)化：在雜交信號的定量分析上，由于標(biāo)記染料的不同，不同來源的檢測結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)化上存在欠缺。盡管基因芯片技術(shù)仍存在很多問題，但其發(fā)展和應(yīng)用前景非常廣闊，隨著基因芯片技術(shù)的日漸成熟，新藥的安全性評價技術(shù)也將更加完善。