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【摘要】目的比較大鼠新生期結直腸刺激和新生期母嬰分離兩種模型的造模效果,評價適用于慢性內臟痛研究的模型。方法雄性新生SpragueDawley(SD)大鼠,隨機分為結直腸刺激(CI)組、母嬰分離(MS)組和對照組。CI組于出生第8~14天每天進行結直腸刺激,MS組于出生第2~21天進行母嬰分離,對照組不予處理。大鼠成年后以腹壁回撤反射(AWR)評分、痛閾測定、腹外斜肌放電(EMG)幅度等指標評價其內臟痛覺敏化程度。結果CI組、MS組的AWR評分、EMG幅度均顯著高于對照組(P<0.05),痛閾測定顯著低于對照組(P<0.05),但兩模型組各項指標比較差別無統計學意義(P>0.05)。結論大鼠新生期結直腸刺激和新生期母嬰分離兩種造模方法都可引起成年大鼠的內臟痛覺敏化,造模效果基本無異,均適用于慢性內臟痛的研究。

【關鍵詞】腸易激綜合征慢性病內臟疾病模型動物疼痛

慢性內臟痛是臨床常見病,同時亦是腸易激綜合征(IBS)等很多疾病的臨床表現之一。近年來研究認為慢性內臟高敏感(慢性內臟痛)是IBS胃腸動力紊亂的原因,因此受到了國內外學者的廣泛關注。目前用于急性內臟痛研究的模型比較成熟,而慢性內臟痛卻缺乏穩(wěn)定可靠的動物模型,因此其研究一直滯后于急性內臟痛和軀體痛。大鼠新生期結直腸刺激(CI)以及新生期母嬰分離(MS)是目前有報道用于研究慢性內臟痛的兩種模型[12],筆者對兩種模型的造模效果進行比較,以評價適合用于慢性內臟痛研究的模型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物及分組清潔級雄性新生SD大鼠3窩,每窩10~12只(福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號SCXK[閩]20040002)。隨機將3窩新生鼠分為CI組、MS組和對照組。

1.1.2儀器20mm×2.5mm人血管重建氣囊(MedtronicAVE,美國SantaRosa公司);多道生理信號采集處理系統(RM6240BD,成都儀器廠);自制乳膠氣囊[1]。

1.2方法

1.2.1模型建立

1.2.1.1CI組大鼠體質量15~18g,于出生后第8~14天每天上午用20mm×2.5mm人血管重建氣囊給予梯度壓力的結直腸擴張,氣囊連接檢壓計控制壓力,每天擴張1次,持續(xù)1min。第8~10天每天擴張前予以生理鹽水0.3mL灌腸;擴張壓力第8~10天為40mmHg（1mmHg=133.3Pa），第11~12天為60mmHg,第13~14天為80mmHg。出生后第22天斷奶,正常分籠飼養(yǎng)。

1.2.1.2MS組大鼠于出生后第2~21天,每天上午與母鼠分開放入另一籠中,移至另一鄰近房間,保持環(huán)境溫度在(32±0.5)℃,3h后放回最初籠中與母鼠團聚。出生后第22天斷奶,正常分籠飼養(yǎng)。

1.2.1.3對照組出生后不給予任何處理,與前兩組同時斷奶,在相同環(huán)境中正常飼養(yǎng)。

1.2.2模型評價指標大鼠成年后(出生后60d),體質量約250g,剔除過輕或過重者,每組8只,雙盲法檢測。實驗時保持安靜,室溫維持在25℃左右。

1.2.2.1腹壁回撤反射(AWR)評分大鼠實驗前禁食不禁水18h,乙醚吸入麻醉,將帶有乳膠氣囊(直徑2.5cm,長6cm)的導管經肛門插入直腸,使氣囊尾端距離肛門1cm,用膠帶固定導管于鼠尾,導管經三通管連接注射器和檢壓計。將大鼠放入有機玻璃觀察箱(20cm×6cm×8cm),待其醒來并適應環(huán)境后進行直結腸擴張(colorectaldistensions,CRD),擴張壓力分別為20,40,60,80mmHg,各壓力持續(xù)20s,間隔4min。根據大鼠反應進行AWR評分。評分標準為[2]:0分:無明顯反應;1分:短暫的頭部運動后停止;2分:腹部肌肉收縮;3分:腹部收縮并提起;4分:弓背并抬起骨盆。各壓力重復作3次擴張并評分,取3次評分的平均數作為該壓力下的AWR評分值。

1.2.2.2痛閾測定以每次5mmHg的遞增壓力加壓,觀察大鼠在3min內AWR評分基本穩(wěn)定保持3分的最小CRD壓力值為痛閾,重復測定3次,每次間隔4min,取平均數作為痛閾[3]。

1.2.2.3腹外斜肌放電(EMG)大鼠實驗前禁食不禁水18h,麻醉并置乳膠氣囊于直腸(方法同1.2.2.1),仰臥位固定,將銀絲雙極電極插入腹股溝韌帶上方距中線1.5cm的一側腹外斜肌上,待其清醒并適應環(huán)境后記錄不同CRD壓力下腹外斜肌放電活動。CRD壓力分別為20,40,60,80mmHg,各壓力持續(xù)擴張20s,間隔4min。

1.2.3組織學檢查頸椎脫臼處死大鼠,取降結腸和直腸,10%福爾馬林固定,石蠟切片,HE染色,由病理學教師觀察大鼠結腸組織結構的變化。

1.3統計學處理各組數據結果用x±s表示,以SPSS13.0軟件對樣本均數進行t檢驗。P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1AWR評分CI組在CRD壓力20~60mmHg、MS組在CRD壓力20~80mmHg均顯著高于對照組(P<0.05);CI組和MS組的AWR評分差別無統計學意義(P>0.05,表1)。表1各組腹壁回撤反射評分n=8.1mmHg=133.3Pa.CRD:直結腸擴張.CI組:新生期結直腸刺激;MS組:新生期母嬰分離.與對照組比較,☆:P<0.05.

2.2痛閾CI組痛閾(20.42±4.25)mmHg,MS組(17.71±2.66)mmHg,均顯著低于對照組(36.25±6.22)mmHg(P<0.05),CI組和MS組痛閾差別無統計學意義(P>0.05)。

2.3EMG平均幅值比較各CRD壓力下腹外斜肌的平均放電幅度與基礎放電幅度的差值,各組基礎放電幅度差別無統計學意義(P>0.05)。CI組在CRD壓力20~40mmHg、MS組在20~60mmHg的EMG幅度顯著高于對照組(P<0.05),2組在各水平CRD壓力下的EMG幅度差別無統計學意義(P>0.05,表2)。

2.4結直腸組織學CI組與對照組相較,結直腸黏膜無明顯改變,黏膜下層結構完整,纖維結締組織無增生,且無淋巴細胞、漿細胞浸潤(圖1)。表2不同CRD壓力下各組腹外斜肌平均放電幅度

3討論

3.1CI模型AlChaer等最早報道的CI模型制備選在大鼠出生后8~21d內每天給予2次CRD60mmHg刺激,從而產生機械傷害性刺激以及一定程度的心理應激,導致成鼠出現臨床IBS樣表現[2];而本研究中CI模型則選在大鼠出生后8~14d內每天上午給予1次CRD刺激,而且CRD壓力隨著乳鼠成長從40~80mmHg逐漸增加,證明同樣會誘發(fā)大鼠成年后持續(xù)性的內臟痛覺敏化,且組織學檢查顯示結直腸無明顯的病理改變。應用梯度式漸進性的CRD,避免了造模早期過高的擴張壓力可能對新生鼠腸壁造成的機械創(chuàng)傷(如結腸出血、破裂等),提高了造模的成功率。林國威等報道在大鼠出生后8~14d內每天下午給予類似的CRD刺激亦會誘發(fā)成鼠內臟痛覺敏化[4]。上述方法造模時間雖有所不同,但并不會顯著影響造模效果。

3.2MS模型本研究中，MS模型制備選在大鼠出生后第2~21天每天進行母嬰分離3h,利用這種早期負性生活事件造成新生期大鼠的心理應激,從而導致其成年后的內臟痛覺敏化[5],與Ren和Kalinichev等報道的MS模型造模效果一致[1,6],不同之處在于后者母嬰分離的時間選擇在出生后第2~14天,每天分離3h。這兩種方法分離時間雖有所不同,但這些早期負性生活事件都引發(fā)了一定強度的心理應激,均可引起大鼠成年后的內臟痛覺敏化。

3.3兩種模型比較

3.3.1操作可控性CI模型制作對操作者的熟練程度有一定要求,初學者可能會因操作不慎而在造模過程中損傷乳鼠的結直腸,從而導致成年后大鼠結直腸的病理學改變,甚至引起乳鼠死亡。而MS模型制作方法簡單、容易控制,即使是初學者造模也易成功。因此,MS模型在操作可控性方面占有優(yōu)勢。

3.3.2造模效果本研究用腹部EMG與AWR評分及痛閾等指標來評價內臟痛覺敏化程度[34,7],CI組的AWR評分在CRD20~60mmHg、MS組在CRD20~80mmHg時顯著高于對照組;2組痛閾均顯著低于對照組;EMG幅度CI組在CRD20~40mmHg、MS組在CRD20~60mmHg時均顯著高于對照組。2模型組AWR評分和痛閾以及EMG幅度差別無統計學意義,CI模型和MS模型均引起了大鼠成年后的內臟痛覺敏化,且兩種模型效果差別無統計學意義。據稱CRD壓力<60mmHg為非傷害性刺激,而≥60mmHg則為傷害性刺激[7]。EMG幅度CI組在CRD20~40mmHg、MS組在20~60mmHg時顯著高于對照組,因此CI組只對非傷害性刺激的痛覺敏感程度顯著升高,而MS組對非傷害性刺激和傷害性刺激的痛覺敏感程度均顯著升高,提示兩種模型的內臟痛覺敏感程度可能有所不同。

本研究發(fā)現,AWR評分與EMG反映的內臟痛敏結果基本一致。筆者認為,AWR評分直觀易行,但作為一種半定量的測量方法,具有一定的主觀性,實驗者可通過雙盲法盡量排除主觀因素的影響;EMG測量較為客觀靈敏,但由于是在清醒狀態(tài)下記錄,易受到大鼠自主運動的影響,因此AWR和EMG兩種評價指標各有優(yōu)勢。

3.4模型選擇慢性內臟痛的發(fā)病可能是多因素綜合作用的結果,炎癥、直腸機械性傷害刺激以及應激等因素均可引起慢性內臟痛[5,811]。CI模型從機械刺激和心理應激角度模擬了內臟痛的發(fā)病機制,MS模型主要從心理應激角度模擬了內臟痛的發(fā)病機制,2種模型最終都成功地誘發(fā)了大鼠成年后的慢性內臟痛,因此均可作為慢性內臟痛研究的模型。因2種模型模擬慢性內臟痛的發(fā)病機制各有側重,筆者認為實驗者可根據研究目的選擇合適的模型,需要時可采用多種方式綜合造模以盡可能接近IBS的病理狀態(tài)。亦有學者提出通過心理和胃腸道生理因素的互動特征,利用條件刺激和非條件刺激來建立慢性內臟痛模型[12],其效果有待于進一步的研究證實。