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作者：王曉紅，羅亞寧，李麗，楊艷紅，閆凱麟，黃劍磊，閔保華

【關鍵詞】凍融

【摘要】目的：研究凍融胚胎移植的臨床應用及分析影響凍融胚胎移植妊娠率的相關因素.方法：對63例80個凍融胚胎移植周期進行回顧性分析，通過IVF或ICSI獲得的剩余胚胎采用慢速法冷凍保存，快速法解凍復蘇.結果：解凍392個胚胎，成活269個胚胎，胚胎復蘇率為68.62%.周期臨床妊娠率為23.75%.每周期植入3個胚胎組的臨床妊娠率顯著高于植入≤2個胚胎組（χ2=4.98,P<0.05）.妊娠周期胚胎細胞完整率及優(yōu)質胚胎率顯著高于非妊娠周期（67.28%vs60.09%,89.09%vs73.55%，均為P<0.025）.結論：凍融胚胎移植的成功率與移植胚胎的數量和質量密切相關.

【關鍵詞】凍融；冷凍胚胎；胚胎移植；妊娠率

0引言

胚胎冷凍技術是將胚胎放入冷凍保護劑中，在超低溫環(huán)境中保存，需要時再將胚胎解凍復蘇的技術，它是“試管嬰兒”即體外受精―胚胎移植（invitrofertilizationandembryotransfer,IVFET）技術的一項重要衍生技術.在本生殖醫(yī)學中心200309/200412間共接受IVF或單精子卵母細胞質內顯微注射（intracytoplasmicsperminjection,ICSI）技術助孕治療的不孕癥患者63例，80個凍融胚胎移植治療周期，80個凍融胚胎移植治療周期中來自IVF71個周期，ICSI9個周期，報道如下.

1材料和方法

1.1材料

冷凍胚胎來源：促超排卵、取卵、體外受精及胚胎培養(yǎng)，均按本中心操作常規(guī)進行，于取卵術后48~72h將2~3個新鮮胚胎移植入子宮腔.剩余的存活胚胎（Fig1A），采用慢速法冷凍保存，快速法解凍復蘇［1］.

1.2方法

1.2.1胚胎冷凍冷凍液CryoPBS：含25g/L人血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液（PBS+25g/LHAS）；FS1:1.5mol/L丙二醇+CryoPBS;FS2:1.5mol/L丙二醇+0.1mol/L蔗糖+CryoPBS.冷凍液及解凍液均來自瑞典Vitrolife公司.在四孔培養(yǎng)皿1,2,3,4號孔中分別加入1mLCryoPBS,FS1,FS2,FS2，室溫平衡.將胚胎放入CryoPBS2~5min后，放入FS1保持10min，再將胚胎放入FS2后裝入麥管并封口.將麥管放入冷凍儀（PlanerKryo3601.7，英國）開始冷凍程序：從18℃起，以2℃/min逐漸降溫至-7℃，此時用液氮浸透的棉簽在麥管接近棉塞的部位進行植冰（seeding），然后以0.3℃/min緩慢降溫到-30℃,再快速降溫至-100℃程序結束，迅速取出麥管，放入液氮罐（-196℃）保存.

1.2.2胚胎解凍解凍液TS1:1.0mol/L丙二醇+0.2mol/L蔗糖+CryoPBS;TS2:0.5mol/L丙二醇+0.2mol/L蔗糖+CryoPBS;TS3:0.2mol/L蔗糖+CryoPBS.將解凍液TS1,TS2,TS3及CryoPBS分別按順序加入四孔培養(yǎng)皿中，從液氮罐中拿出麥管，室溫下解凍30s后，放進30℃水浴中30s.剪去一端或拔掉塞子，接上麥管操作器，然后再剪去另一端，小心地將胚胎吹入TS1中，在TS1中孵育5min，移入TS25min，再移入TS3中5~10min，將胚胎放進CryoPBS，37℃下保持10min.最后將胚胎放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)2~12h，檢查胚胎存活率并記錄胚胎形態(tài)，有半數以上的分裂球存活的胚胎可以移植（Fig1B）.

1.2.3凍融胚胎移植（FET）時機選擇①自然周期（naturalcycles）：規(guī)律月經有排卵的患者一般選擇在自然周期進行FET.在預計排卵日前3~4d行黃體生成素（LH）測定，同時B超監(jiān)測卵泡發(fā)育和排卵，排卵后2~3d或LH峰出現4d后行FET.②激素替代周期（hormonereplacetreatment）：雌激素水平低下的無排卵的患者在激素替代周期內進行FET.從月經周期或撤退性出血的第2~3日起，戊酸雌二醇2~8mg/d,po,10~14d后B超監(jiān)測子宮內膜厚度，當子宮內膜厚度≥8mm時，開始加用黃體酮60~100mg/d，給予黃體酮4d后，解凍胚胎并FET.③促排卵周期（ovarystimulationcycles）：月經稀發(fā)或月經不規(guī)律的患者，可給予克羅米芬（CC）或人絕經尿促性腺激素（HMG）促排卵治療，陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，當主導卵泡直徑≥18mm時給予hCG5~10kU,im.排卵后2~3d或注射HCG后84h行FET.

1.2.4妊娠監(jiān)測于移植后15d查尿或血HCG，若陽性則于停經7wk行B超檢查，見孕囊及原始心管搏動診斷為臨床妊娠，繼續(xù)隨訪至妊娠結束.

統(tǒng)計學處理：年齡、不孕時間、移植胚胎數等定量資料以x±s表示；對計數資料進行χ2檢驗；用SPSS12.0軟件進行多因素Logistic回歸分析.

2結果

2.1一般概況與結局80個FET治療周期，年齡23~36(31.4±3.0)歲，不孕時間1~15(6.3±3.1)a.解凍胚胎392個，復蘇胚胎269個，胚胎復蘇率為68.62%.每周期移植胚胎數1~3(2.6±0.6)個.19例臨床妊娠，臨床妊娠率23.75%（19/80）；流產4例，流產率21.05%（4/19）；多胎5例（均為雙胎），多胎率26.32%（5/19）.已分娩6例，出生嬰兒8（男5，女3）名，體質量(2523.8±497.7)g，隨訪至200412均發(fā)育正常，身體健康.9例繼續(xù)妊娠中.

2.2年齡與臨床妊娠率的關系將病歷資料劃分為2個年齡段，比較臨床妊娠率，兩組間無顯著性差異（χ2=0.84,P>0.05），<30歲組19個周期，臨床妊娠6例，臨床妊娠率31.58%；30~36歲組61個周期，臨床妊娠13例，周期臨床妊娠率21.31%.

2.3不同體外受精方式及不同移植周期類型與臨床妊娠率的關系將病歷資料按不同的體外受精方式劃分為IVF組和ICSI組，比較臨床妊娠率，兩組間無顯著性差異（χ2=0.01,P>0.05），IVF組71個周期，臨床妊娠17例，周期臨床妊娠率23.94%；ICSI組9個周期，臨床妊娠2例，周期臨床妊娠率22.22%.不同類型周期的臨床妊娠率三組間無顯著性差異（χ2=0.16,P>0.05,Tab1）.

2.4移植胚胎數目與臨床妊娠率的關系每周期植入3個胚胎組55個周期，臨床妊娠17例，周期臨床妊娠率30.91%；每周期植入≤2個胚胎組25個周期，臨床妊娠2例，周期臨床妊娠率8%.每周期植入3個胚胎組的臨床妊娠率顯著高于植入≤2個胚胎組（χ2=4.98,P<0.05）.表1不同類型移植周期的臨床結局（略）

2.5影響FET結局的多因素Logistic回歸分析將可能影響FET結局的因素：年齡、不孕時間、受精方式、移植周期類型、移植胚胎數目，進行多因素Logistic回歸分析.結果顯示：移植胚胎數目對FET結局有很大影響，多移植1個凍融胚胎，可使妊娠成功的機率增加約7倍（P=0.017,OR=6.953）；不孕時間對FET結局也有影響，不孕時間每增加1a，妊娠成功的機率減少約30%（P=0.010,OR=0.722）.

2.6妊娠周期與非妊娠周期的比較妊娠周期胚胎復蘇率（復蘇胚胎個數/解凍胚胎個數×100%）與非妊娠周期無顯著性差異（χ2=3.19,P>0.05）；妊娠周期細胞完整率（復蘇后胚胎細胞總數/冷凍時胚胎細胞總數×100%）顯著高于非妊娠周期（χ2=6.21,P<0.025）；妊娠周期優(yōu)質胚胎率（Ⅰ級和Ⅱ級胚胎總個數/移植胚胎總個數×100%）顯著高于非妊娠周期（χ2=5.65,P<0.025,Tab2）.表2妊娠周期與非妊娠周期的比較（略）

3討論

本研究中凍融胚胎移植的周期臨床妊娠率為23.75%，與Karltrom等［2］和Oehninger等［3］22%~25%的研究結果相似.有研究顯示與常規(guī)IVF技術的凍融胚胎移植相比，ICSI治療后的凍融胚胎移臨床妊娠率顯著下降，但也有報道認為兩者無顯著性差異［4］.本結果顯示ICSI技術并未影響凍融胚胎的種植潛能.由于本研究ICSI例數較少，尚需更大樣本的研究加以證實.

關于凍融胚胎移植時機的選擇目前的研究尚無一致的結論.本結果顯示采用不同類型周期移植凍融胚胎，其成功率無明顯差異.我們認為，針對不同的患者，采用不同的方案，實現個體化，盡量使子宮內膜與胚胎發(fā)育同步，提高子宮內膜的容受性，以獲得較高的妊娠率.鑒于自然周期符合生理、簡便、經濟，我們認為有排卵者盡量采用自然周期為宜.

多數研究認同在凍融胚胎移植的治療中，年齡是影響妊娠率的重要因素，尤其是35歲以上，生育力明顯下降.其原因主要是卵巢功能減退，卵子質量及子宮內膜的容受性下降以及遺傳異常影響受精和妊娠的維持.本研究顯示：<30歲組和30~36歲組，周期臨床妊娠率雖未證實有統(tǒng)計學差異，但仍能顯示出妊娠率隨年齡增高而下降的趨勢；妊娠結局與不孕時間有顯著的負相關性，隨不孕時間延長，患者年齡增加，妊娠率降低，所以不孕癥患者及早治療是非常重要的.

凍融胚胎移植的妊娠率與移植胚胎的數量［5］和質量［6］密切相關.本結果顯示，每周期植入3個胚胎組的臨床妊娠率明顯高于移植≤2個胚胎組.多因素回歸分析研究也顯示，妊娠結局與移植胚胎數目有顯著的正相關性.此外，妊娠周期的細胞完整率及優(yōu)質胚胎率均高于非妊娠周期，提示凍融胚胎的質量可能會影響妊娠率.我們推測細胞完整率更為直接地反映了胚胎對解凍過程的耐受情況，可成為預測妊娠結局的一個指標.