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【摘要】目的研究肌肽對應激負荷小鼠糖代謝的影響。方法將雄性KM小鼠分為正常對照組、應激對照組、150mg/kg及300mg/kg肌肽給藥組，每天灌胃給藥1次,連續給藥7d后拘束負荷應激20h灌胃葡萄糖2g/kg，檢測血糖清除率、肝糖原合成能力、糖原合成酶基因表達及皮質酮水平。結果與應激負荷對照組比較，肌肽能提高應激小鼠血糖消除速率，促進糖原合成酶的基因表達，并增強肝糖原合成能力。此外，肌肽還能降低血漿皮質酮的水平。結論肌肽增強應激負荷小鼠肝糖原合成能力，其作用機制可能與肌肽降低體內糖皮質激素水平、激活糖原合酶有關。

【關鍵詞】肌肽;拘束應激;肝糖原;糖皮質激素

近年來隨著社會環境及生活方式的改變，生活及工作的壓力越來越大，由各種應激源導致的亞健康狀態人數也逐年增多。人們長期處于應激負荷狀態下容易導致免疫力下降，導致各種疾病的發生。肌肽是一種具備高效生物活性的天然二肽，廣泛存在于哺乳動物的肌肉組織和神經組織中[1]。研究結果表明，肌肽具有抗氧化抗衰老功能、神經系統保護作用、抗糖基化作用、對腎中毒及肝損傷有一定的改善作用、可防止動脈硬化等生理活性[2,3]。但尚未見肌肽對應激負荷狀態下糖代謝改善作用的報道。本實驗通過觀察肌肽對拘束負荷小鼠血糖濃度和肝糖原合成的影響，以及小鼠血漿中皮質酮變化，探討肌肽對應激引起的機體糖代謝紊亂的改善作用。

1材料與方法

1.1試劑

肌肽(carnosine)、皮質酮(corticoste??rone)標準品及氫化可的松(cortisol)標準品為美國Sigma公司產品;乙腈(色譜純)為FisherScientific公司產品;乙酸乙酯和NaOH為廣州化學試劑廠產品;葡萄糖購自天津藥業;肝糖原試劑盒購自南京建成科技公司;葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業公司;Trizol購自廣州英韋創津生物科技公司;逆轉錄系統PCR試劑盒均購自北京天根生化科技公司;PCR引物根據GenBank提供的基因序列使用PrimerDesign軟件進行設計，引物均由英韋創津公司合成，糖原合酶??2(Gy??2)引物：5′??AACGACAGCCGATGAGT??3′(上游)，5′??CTGGCACGAGAAAGGAT??3′(下游)，其擴增產物長423bp;以18s為內參：5′??GGGAGAGCGGGTAAGAGA??3′(上游)，5′??ACAGGACTAGGCGGAACA??3′(下游)，其擴增產物長241bp。

1.2實驗儀器

高效液相色譜系統(日本HITACHI公司);MK3型酶標儀(Labsystem,Finland);3??18K型臺式高速冷凍離心機(德國Sartorius公司);2720型PCR儀(美國AppliedBiosystems公司);電泳成像系統(美國Bio??RadLaboratories公司);MilliQPlus超級純水儀(美國Millipore公司);電泳儀及水平電泳槽為日本Mupid公司產品。

1.3實驗動物

體質量18～22g，6周齡SPF級雄性昆明種小鼠32只，購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2008??0002。飼養溫度(23±2)℃，照明時間12h/d(7∶00～19∶00)，飼養1周后進行實驗。

1.4動物分組及給藥

將小鼠隨機分為正常對照組、拘束應激對照組、150mg/kg及300mg/kg肌肽給藥組，共4組，每組8只。肌肽給藥組以0.1mL/10g灌胃給藥，正常對照組和拘束應激模型組均灌胃等量空白水，每日1次連續給藥7d。除正常對照組外，所有小鼠均在末次灌胃后30min進行拘束應激實驗，小鼠拘束裝置參照文獻[4]制作，為通風良好的50mL尖底聚丙烯塑料離心管，給予一次性拘束20h(12:00～次日8:00)，拘束期間小鼠不能進食飲水。正常對照組小鼠為禁食禁水小鼠。

1.5小鼠糖耐受實驗[5]

上述各組實驗動物在禁食和拘束結束30min后灌胃葡萄糖2g/kg，口服葡萄糖后0、20、40、60及80min尾靜脈取血于肝素鈉小離心管中，5000r/min5min離心，取血漿用葡萄糖測定試劑盒測定血糖濃度。

1.6HPLC測定小鼠血漿皮質酮的含量

取小鼠全血置于肝素處理過的離心管中，以5000r/min離心5min分離血漿。取0.5mL血漿，并添加入2mL乙酸乙酯振搖萃取，分離得到上層乙酸乙酯液，下層水液再用乙酸乙酯萃取1遍，合并乙酸乙酯液后用0.1mLNaOH洗1次，再用蒸餾水洗2次。乙酸乙酯液置于氮氣下揮發吹干后加入100μL流動相(乙腈∶水=38∶72，體積比)溶解即得皮質酮分析樣品溶液。按Woodward等人的方法，采用HPLC內標法(內標物為cortisol)測定血漿中皮質酮含量[6]。檢測條件為：紫外檢測，檢測波長為254nm;色譜柱：5C18(4.6mm×150mm，5μm);流動相：乙腈?菜?(38%∶72%);流速：1mL/min。

1.7肝糖原合成測定

測定血糖濃度后，小鼠在乙醚麻醉下取出肝臟，按肝糖原試劑盒方法測定肝糖原含量。

1.8半定量RT??PCR檢測Gy??2mRNA的表達

取肝臟組織，用Trizol提取總RNA，逆轉錄反應以總RNA3μg為模板，總反應體系20μL，42℃水浴1h合成cDNA。PCR反應條件設置：94℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸50s，進行30次循環，最后72℃延伸7min，同法以18s為內參進行PCR擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，Bio??rad凝膠成像系統記錄結果，QuantityOne軟件進行灰度分析。結果以Gy??2與內參照物18smRNA擴增片段灰度值的比值表示Gy??2mRNA相對水平。

1.9數據統計與分析

實驗數據以(±s)表示，采用SPSS軟件，利用ANOVA檢驗進行統計學處理，P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1肌肽對拘束負荷小鼠糖耐受的影響

結果見表1、圖1。口服2g/kg葡萄糖后與正常對照組相比，拘束應激小鼠的血糖濃度上升明顯，在20、40和60min時具有統計學差異。與應激對照組相比(P<0.01)，肌肽高低劑量給藥組均能使應激小鼠血糖濃度明顯降低，提高糖耐受能力，結果表明肌肽能提高應激小鼠血糖消除速率。表1肌肽對拘束應激小鼠糖耐受的影響與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01;與應激對照組比較：△P<0.05，△△P<0.01

2.2肌肽對拘束負荷小鼠血漿皮質酮水平及肝糖原合成的影響

結果見表2，與正常對照組相比，拘束應激使小鼠血漿皮質酮水平顯著上升(P<0.01)，肝糖原合成能力顯著下降(P<0.01)。與應激對照組相比，肌肽高低劑量給藥組均能降低拘束應激引起的血漿皮質酮上升(P<0.01)，促進肝糖原的合成(P<0.05)。

2.3肌肽對拘束應激小鼠糖原合成酶表達的影響

目的基因Gy??2(糖原合成酶)與內參基因18s的RT??PCR擴增產物的A目的基因/A內參基因能反映Gy??2基因的轉錄水平，比值越大，Gy??2轉錄水平就越高。如圖2和圖3所示，與正常對照組相比，拘束應激后Gy??2的表達明顯降低，與空白對照組比較差異非常顯著(P<0.01)。高低肌肽給藥組Gy??2的表達明顯升高，與拘束應激組比較差異顯著(P<0.05)。表2肌肽對拘束應激小鼠血漿皮質酮水平和肝糖原合成的影響

3討論

機體在應激負荷時激活交感神經?采鏨舷偎柚氏低常?產生大量兒茶酚胺、興奮性氨基酸，導致下丘腦?泊固濯采鏨舷僦?(HPA)功能亢進,血液中皮質醇濃度增高[7]。糖皮質激素的釋放增加，促進糖原分解和糖異生作用，抵制外周組織對葡萄糖的轉運和利用，快速升高血糖[8]。實驗結果表明，小鼠拘束應激20h口服葡萄糖后血糖濃度顯著升高，血糖值在20、40、60min時顯著增加。150、300mg/mL肌肽給藥能降低拘束應激小鼠血糖濃度，改善因應激負荷導致的血糖利用率低下。同時150、300mg/mL肌肽給藥能顯著降低拘束應激小鼠血漿皮質酮水平，促進肝糖原合成，降低糖皮質激素水平，增強葡萄糖的儲備，改善了機體應激后導致的能量供應不足的狀況。

糖原合酶(glycogensynthase,Gys)是肝和肌肉糖原合成的關鍵限速酶，其中糖原合酶??2(Gy??2)主要存在于肝臟中，調節肝糖原的合成。糖皮質激素通過調控cAMP和Ca2+這2個信號分子，激活糖原合成酶激酶使糖原合成酶磷酸化而活性降低[9,10]。本實驗結果表明150、300mg/mL肌肽給藥能夠促進Gy??2mRNA表達，提高肝糖原合成能力，其機制可能與肌肽能顯著改善機體糖皮質激素水平，激活糖原合成酶激酶，繼而使糖原合成酶去磷酸化被激活有關。新晨

肌肽作為一種新型高效天然抗氧化肽受到了國內外普遍關注，肌肽不僅具有抗氧化，抗糖基化，提高免疫力和緩解老年性疾病等作用，而且近年來肌肽藥物已經開發應用于臨床。本研究結果顯示肌肽能顯著提高拘束應激小鼠血糖利用率，降低血漿皮質酮水平，促進肝糖原合成能力及改善機體能量利用不足等作用，為肌肽的應用與開發提供一定的實驗依據。

【參考文獻】

[1]QUINNPJ,BOLDYREVAA,FORMAZUYDVE.Carnosine:Itsproperties,functionsandpotentialtherapeuticapplications[J].MolecularAspectsofMedicine,1992,13(5):379-444.

[2]臧國雄,王輝,許素華,等.肌肽及其生理活性研究進展[J].食品科學,2009,30(09):272-276.

[3]沈杰,劉超,陳鈞輝.肌肽在醫藥方面的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2008,29(02):134-137.