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1、HO–1的生物學特性
HO–1為誘導型,HO-1基因內含有HSE元件,與HSP70和應激蛋白P32結構類似,所以有人將其歸入HSP家族,亦稱為HSP32。分子量為32kD,熱休克處理在引起HSP70表達上調的同時也導致HO-1的表達上調。且熱休克對大鼠心肌線粒體呼吸功能的保護作用與這兩種應激蛋白均有關。生理狀態下,在網狀內皮細胞系統和骨髓表達,肝臟、脾臟中高濃度存在,可被多種物質或刺激因素誘導表達,如四氯化碳、撲熱息痛、重金屬、血紅素及其衍生物、炎性刺激、應激、生物激素、低氧等應激狀態均可使細胞內HO-1的活性上調[1]。而多數金屬卟啉是HO-1的抑制劑,如鋅原卟啉及錫原卟啉等,可抑制HO-1的表達和活性。
現已證實HO-1是一種應激蛋白,HO-1在正常情況下低表達或不表達,但在應激狀態下HO-1適量表達可以減輕細胞損傷、蛋白質氧化及脂質過氧化,減輕血管緊張素Ⅱ引起的內皮細胞損傷,對血管損傷的修復有潛在保護作用。研究表明,CO誘導HO-1活性增強可減輕內皮細胞的氧化損傷和凋亡,降低培養的內皮細胞對H2O2造成的氧化性損傷的敏感性,血紅素誘導的HO-1活性增加可減少過氧亞硝基引起的主動脈內皮細胞的凋亡[2],HO-1的體內外誘導均能提供抗氧化應激的保護作用,Grosse等[3]在培養的人內皮細胞研究中發現,L丙氨酸(L-alanine)可使HO-1活性增加,并降低H2O2的細胞毒性作用。氧自由基形成的動物模型研究表明[4]在大鼠冠脈缺血/再灌注模型中,將SD大鼠全身預熱15min(肛溫42℃),實驗前室溫恢復24h,再行冠狀動脈阻塞45min后開放冠狀動脈再灌注3h,以心肌梗死大小和血清肌酸激酶活性評估心肌損傷的程度,測定心肌組織中HO-lmRNA和蛋白質的表達。熱預處理組減少再灌注時心肌梗死的面積和肌酸激酶釋放,該作用被ZnPP-IX(HO抑制劑)和亞甲藍安全阻斷,熱應激增加HO-lmRNA和蛋白質表達,但該作用不被亞甲藍阻斷[5]。
2、HO-1基因的誘導產生、表達調節及信號傳導
2.1誘導HO-1表達的分子調節機制十分復雜。目前已經確定HO-1的編碼基因定位于人染色體22q12,含5個外顯子,長約14kb,研究發現,人HO-1基因啟動區所特有的(GT)n微衛星結構的長度直接影響HO-1基因的轉錄水平,(GT)n越長,即GT二核苷酸序列重復數越多,HO-1基因轉錄和表達的水平就越低。體外實驗表明HO-1基因啟動子微衛星影響HO-1的轉錄,在同等程度的氧化應激作用下,GT重復<25次者,HO-1基因轉錄增加;而GT重復≥29次者,則轉錄水平增加不明顯,因此GT重復次數可間接反映人體內HO-1的表達水平,由此可見,HO-1的表達可以在轉錄水平和蛋白水平調控。
HO-1的誘導產生HO在人多數組織內呈低水平表達可被多種傷害性刺激誘導產生高水平的表達在神經和肝臟和脾臟表達最高[6]。這些誘導劑包括血紅素,高氧、缺氧、熱體克、內毒素、過氧化氫、細胞因子、紫外線、重金屬和NO等,這些誘導劑的共同特征是可以產生氧化應激。目前有關NO對HO-1的誘導產生研究最多,多數的文獻報道指出NO作為一種經典的信號分子能夠調節HO-1基因的表達。但也有相反的報道顯示HO-1的產生為NO非依賴性的[78]。這可能與其研究的模型和組織不同NO的轉錄不同有關,其具體的機制有待于一步研究。
2.2HO-1基因表達的調節,目前的研究表明,HO-1基因表達的調控主要發生在轉錄水
平HO-1基因含有4個內含子和5個外顯子,在HO-1基因5,非轉錄區(UTR)即基因啟動子區包含一些增強子和調節片段,包括激活蛋白-1結合位點、金屬反應片段、抗氧化反應片段、熱體克和血紅素反應片段、腫瘤基因雜二聚體結合位點、GCbox(Spl)結合位點,轉錄因子如氧化應激反應轉錄因子NF-κB和AP-1等與這些特殊位點結合可導致HO-1基因激活。轉錄因子AP-1是一個對氧化還原敏感的轉錄因子,可以激活許多基因包括HO-1的表達參與氧化應激的保護性反應AP-1在調節HO-1基因轉錄中的作用最近才被研究證實,NF-E2相關因子2(Nrf2)尤其重要在對Nrf2基因缺陷的巨噬細胞研究中發現,轉錄因子Nrf2可與相關基因抗氧化反應成分相互作用,從而調節相關基因表達,在氧化應激誘導的細胞反應中起重要作用[9]。小鼠HO基因的增強子區域有一個10bp的序列,對于除缺氧以外的各種因子誘導的HO基因表達十分必要,這一序列被稱為應激反應成分(StRE)小鼠StRE區域包含有轉錄因子AP-1家族或轉錄因子的結合區,StRE中AP-1結合區域基因突變將導致HO基因表達失活,不受重金屬、過氧化氫及LP5等的刺激,顯示了AP-1蛋白在HO-1基因表達調控中的作用。此外還有HO基因DNA結合部位包括低氧介導因子-1(HIF-1)和介素6(IL-6)反應成分。HIF是氧敏感基因的轉錄激話因子可結合小鼠HO-1基因的缺氧反應成分。缺氧反應成分的突變將導致HIF-1結合的失敗從而導致缺氧依賴性HO基因表達的失話,表明激動子HIF-1參與缺氧誘導的HO基因表達。IL-6是已知的激話HO基因轉錄的細胞因子中的一種。研究證實HO-1基因5,端的基因序列為IL-6的結合反應區域。
2.3HO-1和信號轉導MAP激活酶(有絲分裂原激活蛋白激酶)是細胞外刺激通過激活轉錄因子調節基因表達的信號傳導系統的重要激酶。據報道,有三種MAP激酶亞家族:細胞外信調節激酶(ERK),c-junN末端激酶(JNK)和p38家族。ERK可被有絲分裂原激活參與細胞生長和增殖的調節,另外兩種激酶與細胞內應激信號有關,因此又被稱為應激激活的蛋白激酶。這幾種激酶的作用底物及其激動因子有很大的重疊。由于MAP激酶和HO-1均可被應激性刺激激活,并且磷酸化參與了HO-1基因的誘導產生。因此很容易理解MAP激酶信號轉導途徑參與了HO-1基因的表達。Lu等通過應用ERK和p38通路的化學性阻斷劑實驗研究,報道ERK和p38通路組分的持續激活可導致HO-1基因表達增加。FurstR等[10]研究發現在培養的人臍靜脈內皮細胞,水楊酸鹽可以通過激活JNK/AP-1通路上調HO-1基因的表達。另有證據表明MAP激酶途徑也參與了HO反應產物的激活。CO作為HO-1分解血紅素的一種產物,具有細胞保護、抗凋亡作用,是通過MAP途徑尤其是p38途徑所介導的[11]。
3、HO-1與ALI研究現狀
3.1HO-1的抗氧化作用
傳統觀念認為,膽紅素是人體內的一種有害物質。但隨著人們對HO/CO-膽紅素系統研究的不斷深入,發現它不只是體內的代謝產物,在一定濃度下還是一種內源性強抗氧化劑具有抗氧化、抗脂質過氧化、保護細胞免受損傷及增強維生素C和E的抗氧化能力等作用[5]。多種應激因素如過量血紅蛋白、低氧、膿毒血癥引起的急性中毒、化學因素導致的ALI以及器官的缺血-再灌注損傷均可誘導HO-1產生。這些誘導產生的HO-1可增加細胞的抗氧化作用。Jinaw等[12]研究發現在LPS大鼠肺損傷模型中通過誘導肺組織加HO-1表達能明顯抑制MDA、TNF-a、NO等,減輕肺水腫、抑制脂質過氧化。
3.2HO-1對NF-кβ及細胞因子的影響
NF-кβ是DNA結合蛋白,是重要的轉錄因子。NF-кβ激活后能使多種細胞因子大量表達,因此在各種細胞外刺激介導的細胞信息的轉導調控中起中心作用。當細胞受到早期反應細胞因子TNF-a、IL-1β和LPS刺激時,激活細胞內信號通道、胞內信號識別和蛋白水解,使得細胞核局部信息暴露,激活NF-кβ。活化的NF-кβ與位于基因啟動子和增強子的кβ序列位點發生特異性的結合。參與眾多與免疫和炎癥反應有關的基因的轉錄調控,在一系列的由細胞因子、炎癥介質及蛋白酶類參與AIL的發病過程中發揮重要的作用。各種原因引起AIL均有大量細胞因子產生,如TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8等,這些細胞因子引起一系列的炎癥級鏈反應,參與肺損傷過程。SaskiI等[13]研究發現失血性休克肺動物模型中,用精氨酸血紅素誘導HO-1的表達能明顯抑制NF-kB和AP-1從而減少肺損傷。LiuSH[14]等發現在內毒素肺損傷模型中吸入低流量的CO(2.5*10-4V/V)能明顯誘導HO-1mRNA表達,抑制TNF-a,IL-6,IL-10,MDA,MPO,及肺臟的細胞凋亡。提示HO-1表達增加對肺臟具有保護作用。
3.3HO-1對NO及合成酶的影響
NO主要由血管內皮細胞產生,血小板、巨噬細胞、中性粒細胞以及腦組織均含有一氧化氮合成酶(iNOS)。生理濃度的NO可維持血管的舒張狀態。因此,用于治療持續性肺高壓,慢性阻塞性肺疾病,肺血管收縮的ARDS患者。然而,體內NO過多,也可產生一系列病理變化,用內毒素刺激內皮細胞產生過量NO,可導致內皮細胞損傷和死亡。iNOS作為一重要的促炎介質,其表達調控中最重要的是轉錄水平的調節。在正常生理情況下,iNOS不表達或低水平表達。在ALI病人,iNOS在嚴格調控下的誘導表達對于補償內源性NO不足起重要作用,然而,一旦這種控制失效,iNOS過量產生就會誘導大量NO的產生。高水平的NO發揮其自由基性質的細胞毒作用,造成肺損傷。甚至血壓下降和體克而危及生命。脂多糖致AIL時iNOSmRNA表達也增強,其大量生成的NO可與超氧陰離(O-)反應生成過氧化亞硝基陰離子(CNOO-),其通過對肺泡表面活性物質(PS)及內皮的毒性作用損傷肺組織。NO和iNOS在肺損傷發病機制中具有重要作用。HuangTY[15]等研究發現在脂多糖引起的大鼠肺損傷中,通過氯高鐵血紅素或高壓氧誘導HO-1的表達增加能明顯抑制iNOS表達減少NO的產生。ZhanLy等[16]發現在內毒素肺損傷模型中,預先給赤芍能明顯的誘導肺組織HO-1的表達,從而抑制iNOS表達,減輕肺損傷。
4.3HO-1對細胞凋亡影響
細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡過程,在此過程中,特定的死亡信號通路被激活,導致細胞從組織中清除。細胞凋亡的最終結果是導致DNA碎裂,細胞體積變小,凋亡的細胞被鄰近的吞噬細胞吞噬。當細胞凋亡受到不適當的激活或抑制時,均可導致疾病的形成。目前認為主要有兩類細胞凋亡與ALI發病機制密切相關,即多形核中性粒細胞(PMN)與上皮細胞的凋亡。關于前者,研究人員認為PMN凋亡在炎癥消退過程中發揮著重要作用,在ALI發病過程中,PMN的凋亡以及凋亡細胞清除受到抑制都是不利的[17]。人們觀察到在ALI發病過程中,上皮損傷與可溶性介質導致的肺上皮細胞凋亡有關,并猜測使用相關阻斷劑對ALI的治療可能是有益的[18]。Otterbein等在培養的大鼠成纖維細胞中加入HO-1誘導劑可抑制由TNF-α引起的細胞凋亡,而用HO-1抑制劑可抑制HO-1的抗凋亡作用。
5、問題與展望
綜上所述,HO-1作為一種有催化活性的應激蛋白有著廣泛的生物學活性,機體處于氧化應激狀態時,HO-1高效表達,保護機體免受損傷。所以,HO-1在氧化應激中的作用值得進一步研究。隨著研究的不斷深入,HO-1的作用機制日漸明朗,將可能開辟一個新的藥物研究領域,如用“非應激”刺激物在體內誘導HO-1基因表達可能是今后治療性干預氧化性損傷的新的有開發前景的方法,如水楊酸鹽可以通過激活JNK/AP-1通路上調HO-1基因的表達。赤芍、阿司匹林等可誘導HO-1在肺組織細胞和培養的內皮細胞上表達,并已顯示HO-1具有保護內皮細胞對抗TNF-α介導的細胞毒性以及肺組織細胞對抗氧化應激引起的缺血再灌注損傷等作用。但尚需深入研究調控各種刺激因素誘導HO-1基因轉錄與表達的分子學機制及其意義。