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1微衛(wèi)星dna與遺傳標(biāo)記的發(fā)展

當(dāng)DNA上的多態(tài)性順序與某一位點(diǎn)(常用在致病位點(diǎn))連鎖時(shí),我們便可利用其作為一種標(biāo)記物,進(jìn)行遺傳缺陷的產(chǎn)前診斷、雜合子攜帶者的鑒定以及親子鑒定、群體研究等。遺傳標(biāo)記的發(fā)展大致可以分為RFLP、VNTR(主要指小衛(wèi)星DNA)、微衛(wèi)星DNA3個(gè)階段。1978年Kan和Dozy第1次發(fā)現(xiàn)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)并用于鐮刀形細(xì)胞貧血癥的診斷。1980年Bostein等預(yù)言有可能利用分布在整個(gè)基因組中的RFLP作為連鎖研究的遺傳標(biāo)記。但RFLP酶切片段在人群中的高頻率雜合子往往較難發(fā)現(xiàn),在基因組中的多態(tài)程度往往也較低,這就限制了其應(yīng)用。小衛(wèi)星DNA是RFLP之后的又一類多態(tài)性遺傳標(biāo)記。它首先由Wyman和While在篩選人類基因文庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn),隨后Bell等又在人胰島素基因上游363bp處發(fā)現(xiàn)一種小衛(wèi)星DNA。它也具有種類多,分布廣,高度多態(tài)等特點(diǎn),作為一種遺傳標(biāo)記,它比RFLP更具有應(yīng)用價(jià)值。1989年Litt和Weber等兩個(gè)研究小組分別用PCR證明一種(CA)/(GT)的二核苷酸串聯(lián)重復(fù)順序具有高度的多態(tài)性[4,5];隨后Edwards等又發(fā)現(xiàn)了三核苷酸和四核苷酸串聯(lián)重復(fù)順序的多態(tài)性[6],人們稱這種串聯(lián)重復(fù)順序?yàn)槲⑿l(wèi)星DNA,從符合遺傳標(biāo)記的高度多態(tài),雜合性高,突變率低等標(biāo)準(zhǔn)來(lái)說(shuō),微衛(wèi)星DNA比小衛(wèi)星DNA更優(yōu)越;且在方法上由于微衛(wèi)星DNA長(zhǎng)度較短,更適合于PCR擴(kuò)增。1991年“冷泉港基因組作圖和序列分析會(huì)議”提出了對(duì)微衛(wèi)星DNA研究的重視和投入。盡管人們首先發(fā)現(xiàn)的是二核苷酸微衛(wèi)星DNA,但現(xiàn)在人們正把目光越來(lái)越多地投向三核苷酸微衛(wèi)星DNA和四核苷酸微衛(wèi)星DNA,三核苷酸微衛(wèi)星DNA和四核苷酸微衛(wèi)星DNA也顯示出二核苷酸微衛(wèi)星DNA那樣的多態(tài)性,但更易檢測(cè),且電泳圖譜上沒(méi)有二核苷酸微衛(wèi)星DNA常常產(chǎn)生的復(fù)合帶紋[原因是DNA雙鏈在變性膠上解開(kāi),含(AC)重復(fù)的鏈與含(TG)重復(fù)的鏈移動(dòng)速率不同]。Edwards等研究表明三聯(lián)和四聯(lián)重復(fù)順序比二聯(lián)重復(fù)順序變異性更高且擴(kuò)增更忠實(shí),且發(fā)現(xiàn)只有三聯(lián)重復(fù)順序可能存在于編碼區(qū),如他們發(fā)現(xiàn)(AGC)重復(fù)順序存在于人雄激素受體基因和果蠅切跡基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)[6]。目前三聯(lián)與四聯(lián)重復(fù)順序的不穩(wěn)定性與人類疾病的關(guān)系正越來(lái)越多地引起人們的注意。

2微衛(wèi)量DNA在醫(yī)學(xué)遺傳中的應(yīng)用

2.1微衛(wèi)星DNA與基因定位和基因組研究基因定位最早是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)植物中進(jìn)行的。1911年Wilson利用連鎖分析第一次將色盲基因定位在X染色體上。但是運(yùn)用連鎖分析定位孟德?tīng)栠z傳式疾病的致病基因以及連鎖圖譜的完成需要高效標(biāo)記的獲得,長(zhǎng)期以來(lái)由于缺少一種既具高信息量又均勻分布的標(biāo)記,連鎖圖譜一直是項(xiàng)費(fèi)力費(fèi)時(shí)的工作。遺傳標(biāo)記的多態(tài)性信息量(PIC)是指某一家系可以利用某一多態(tài)性位點(diǎn)或單體型作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因連鎖分析的概率,通過(guò)PIC可以衡量一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的好壞。一個(gè)好的多態(tài)性位點(diǎn)應(yīng)具有的特性是:檢測(cè)方法簡(jiǎn)單可行;與被檢測(cè)的致病位點(diǎn)盡可能近,即緊密連鎖;各等位基因在群體中的頻率盡可能高,即有較高的雜合度,使被測(cè)個(gè)體在該位點(diǎn)盡可能為雜合子。微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)使基因組的遺傳圖譜工作進(jìn)入了一個(gè)新的階段,并且使疾病基因的定位也更容易。其原理是:對(duì)特定染色體上的特定遺傳標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增,首先將其連鎖到染色體某一區(qū)帶然后依次減小到物理距離,這些標(biāo)記也可用于YAC物理圖譜以及遺傳圖譜與物理圖譜的相互關(guān)系上。微衛(wèi)星DNA的擴(kuò)增片段一般在100～500bp,在聚丙烯酰胺順序膠上可達(dá)到一個(gè)堿基的分辨率。用微衛(wèi)星DNA作標(biāo)記可使人類遺傳性疾病基因的定位能在半年甚至更短的時(shí)間內(nèi)就能完成,并且隨著標(biāo)記的增多,連鎖距離能被減小到幾個(gè)厘米。這種進(jìn)展在其它哺乳動(dòng)物,如大鼠和小鼠中也得到實(shí)現(xiàn)。Murry等用微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了人的高分辨全基因組圖譜,篩選出500個(gè)GATA類的克隆,15個(gè)CEPH家族的標(biāo)記定出了基因型,而且將基因型信息不斷加入遺傳圖中。Wilsondisease(WND)是一種常染色體隱性遺傳病,Bowcock等將疾病相關(guān)基因定位在D13S31與D13S59之間,并且構(gòu)建了一個(gè)YAC,長(zhǎng)約4.5mb,包括9個(gè)高度多態(tài)的微衛(wèi)星標(biāo)記,D13S31與D13S59也在其中[7]。到目前為止,微衛(wèi)星DNA在應(yīng)用上最成功的例子要數(shù)人和小鼠基因組高密度連鎖圖譜的完成[8]。《Science》1994.9報(bào)道:經(jīng)過(guò)3個(gè)發(fā)掘微衛(wèi)星DNA的團(tuán)體和110個(gè)CEPH合作者的努力,已經(jīng)完成了一個(gè)完整的連鎖圖譜,它包括5840個(gè)位點(diǎn)(其中970個(gè)為單一順序),涵蓋4000個(gè)cM;在這些位點(diǎn)中,3617個(gè)為微衛(wèi)星標(biāo)記,427個(gè)為基因,平均每0.7個(gè)cM就有一個(gè)標(biāo)記。這一成功為物理圖譜的完成做了很好的準(zhǔn)備,達(dá)到了人類基因組工程的第一個(gè)目標(biāo)。有研究表明,在所有已完成的人群多態(tài)性研究中,Y染色體表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)偷亩鄳B(tài)性,迄今為止發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星位點(diǎn)僅為10個(gè)左右,但是Y染色體連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)在進(jìn)化研究中卻有其獨(dú)特地位,原因在于其父系遺傳方式和無(wú)重組現(xiàn)象[9]。另外對(duì)于微衛(wèi)星DNA的研究也要注意一個(gè)問(wèn)題:即突變頻率有時(shí)是不可忽略的;這種突變率在不同標(biāo)記間是不同的,估計(jì)在10-5～10-3之間,某些標(biāo)記可能更高一些,這在連鎖不平衡研究和其他非參數(shù)分析中必須考慮到,尤其在等位基因頻率計(jì)算中要注意。此外微衛(wèi)星DNA的多樣性在非洲人中是最高的,這與其他遺傳標(biāo)記正好相反,但是卻支持了非洲起源的假說(shuō)[10]。

2.2微衛(wèi)星DNA與遺傳性疾病及腫瘤大量實(shí)驗(yàn)表明微衛(wèi)星DNA重復(fù)單位數(shù)目的不穩(wěn)定性與一些人類遺傳性疾病有關(guān),到目前為止已發(fā)現(xiàn)有8種相關(guān)的疾病,屬于CGG/CCG重復(fù)的有:脆性X綜合征、Fraxe綜合征;屬于CAG/CTG重復(fù)的有:重癥肌無(wú)力(DM)、X連鎖的脊柱和延髓肌萎縮(X-linkedspinalandbul-barmuscularatrophy)、脊髓與小腦運(yùn)動(dòng)失調(diào)-Ⅰ型(Spinocerebellarataxiatype-1,SCA1)、Huntington舞蹈征、齒狀核與蒼白球萎縮征(Dentatorubral-palli-doluysianatrophy)、Machado-Joseph綜合征。在脆性X綜合征中,FMR1gene中的(CGG)順序在正常人中的重復(fù)次數(shù)少于60次,攜帶者60～100次,而發(fā)病者則多于100次[11]。Huntington舞蹈癥的突變基因中(CAG)重復(fù)次數(shù)往往超過(guò)35次,Andrew等證明擴(kuò)展的(CAG)序列在通過(guò)種系的傳遞過(guò)程中是不穩(wěn)定的[12]。而對(duì)于MJD,在MJD基因(14q32.1)中的(CAG)重復(fù)次數(shù)在正常人為12～37次,而發(fā)病者為62～84次,并且發(fā)現(xiàn)男性比女性變異大[13]。Richard和Southerland稱這種不穩(wěn)定的突變?yōu)閯?dòng)態(tài)突變,突變情況和重復(fù)單位數(shù)目有關(guān),且突變體往往具有和前一輩不同的突變頻率。最近發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星DNA與腫瘤的密切關(guān)系更引起了人們的極大興趣。Peltomaki發(fā)現(xiàn)了遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(HNPCC)與微衛(wèi)星DNA的密切關(guān)系。作者一共用了345個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)HNPCC基因與D2S123標(biāo)記緊密連鎖,并且大多數(shù)HNPCC腫瘤中的D2S123片段電泳泳動(dòng)速率與正常組織中的片段不同,在D2S123標(biāo)記兩側(cè)的D2S119、D2S147以及其他染色體上的某些標(biāo)記片段也有電泳速率的改變,說(shuō)明各標(biāo)記片段長(zhǎng)度有變化。這種微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)存在于HNPCC腫瘤中,但在散發(fā)性腫瘤中非常少見(jiàn)[14]。此外Thibodean等在對(duì)90例結(jié)直癌研究中也發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象,變化程度為從2bp到大片段的缺失或擴(kuò)增[15]。因?yàn)樽訉m內(nèi)膜癌常與HN-PCC關(guān)聯(lián),Burks等研究了30例子宮內(nèi)膜癌患者,發(fā)現(xiàn)7例(23%)表現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象,作者認(rèn)為這種遺傳上的變異可能是此類腫瘤在發(fā)生上的重要特征。Ionov則發(fā)現(xiàn)12%的結(jié)直腸癌在(AT)順序和其他簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)順序上存在缺失,作者認(rèn)為這種突變可能反映了結(jié)腸的癌變是由于DNA復(fù)制或修復(fù)的不忠實(shí)造成[16]。近來(lái)利用微衛(wèi)星DNA對(duì)乳腺-卵巢癌的研究大大增多,研究首先是用許多微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)患者家系進(jìn)行連鎖分析,將疾病相關(guān)基因定位于17q21,命名為BRCA1[17,18],現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的BRCA1突變是第2個(gè)外顯子中一個(gè)2bp的缺失[19]。

2.3個(gè)體識(shí)別Southern雜交技術(shù)和大量VNTRs位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)使DNA作圖廣泛應(yīng)用到個(gè)體識(shí)別上,于是VNTR很快取代了以往的HLA分型?，F(xiàn)在又發(fā)展到應(yīng)用微衛(wèi)星DNA來(lái)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。其優(yōu)點(diǎn)在于快速、簡(jiǎn)便、所需DNA量少,相比較Southern分析,只需要其1/10～1/100量的DNA,來(lái)自粗血溶解物或?yàn)V紙上的一點(diǎn)血跡就可以進(jìn)行分析,這一特點(diǎn)大大適用于法庭分析,因?yàn)檫@種情況下往往不可能得到完整的高分子量DNA。在操作方法上可以使用多重PCR來(lái)簡(jiǎn)化分析,引物設(shè)計(jì)在24bp左右,(GC)含量約為50%,因此所有擴(kuò)增反應(yīng)都有相近的溶解溫度,可以一次同時(shí)進(jìn)行。Alford等利用9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記做了50例親子鑒定,準(zhǔn)確率達(dá)99.73%[20]。Hammond等用13個(gè)不相連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)4組人群進(jìn)行了分析,并且證明可以用在解決實(shí)驗(yàn)室樣品的混淆、骨髓移植、親子鑒定、性襲擊以及各種刑事鑒定中[21]。有些學(xué)者還利用了微衛(wèi)星DNA對(duì)某些古代人的遺跡進(jìn)行分析,這在考古學(xué)方面顯然是一個(gè)新的應(yīng)用,但要避免樣品的混淆和真?zhèn)螁?wèn)題。此外目前應(yīng)用在個(gè)體識(shí)別上的建立在PCR基礎(chǔ)之上的方法也尚有不足:(1)大多數(shù)微衛(wèi)星標(biāo)記的變異是有限的,平均雜合度小于70%～80%,因此往往需要超過(guò)9個(gè)(可能要18個(gè))位點(diǎn)才能起到作用;(2)易受近親繁殖和人群結(jié)構(gòu)的影響。Pena認(rèn)為目前的檢驗(yàn)方法若配合多位點(diǎn)的微衛(wèi)星探針(MLP)或恰當(dāng)數(shù)目的單位點(diǎn)探針(SLP)會(huì)更有效[22]。