本站小編為你精心準(zhǔn)備了悅目金蛛粗毒提取參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。
【摘要】目的了解掌握悅目金蛛生活習(xí)性和形態(tài)特征，分析毒腺形態(tài)與體量的相關(guān)性，優(yōu)化明確制毒路線，獲得較純生理活性較高的蜘蛛粗毒。方法通過(guò)毒腺形態(tài)解剖，借助數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法分析了毒腺形態(tài)與蜘蛛體量的相關(guān)性；采用毒腺解剖法直接獲取性質(zhì)穩(wěn)定和最多量的蛛毒粗品，以雞紅細(xì)胞為模型檢驗(yàn)了粗毒效價(jià)，探索了毒素離子通道抑制類型。結(jié)果毒腺重量與體量呈正相關(guān)，按照優(yōu)化后的制備方法和技術(shù)線路，制得5mg悅目金蛛粗毒；悅目金蛛毒素有促進(jìn)紅細(xì)胞凝集和裂解作用，在鈣離子環(huán)境下毒素對(duì)紅細(xì)胞的裂解作用更強(qiáng)。結(jié)論利用毒腺解剖法能夠獲得最大量更高純度的蛛毒，初步確定了蛛毒當(dāng)中含有凝集素和磷脂酶兩種成分。
【關(guān)鍵詞】悅目金蛛；毒腺解剖；粗毒；細(xì)胞毒理
蜘蛛是害蟲的重要天敵，以其毒素麻痹殺死獵物。蜘蛛毒素成分復(fù)雜，主要為蛋白質(zhì)和多胺類物質(zhì)，蛋白質(zhì)包括各種多肽神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、酶、激肽類似物、凝集活性肽和抗菌肽等，多胺類物質(zhì)有ATP、核苷酸、氨基酸、多胺、單胺類等低分子量物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽等。蜘蛛毒素具有多種活性，現(xiàn)已證實(shí)含有多種特異性多肽配體，可以選擇性地和K+、Na+、Ca2+通道的亞型相結(jié)合［1～11］。國(guó)內(nèi)梁宋平等［12］對(duì)虎紋捕鳥蛛、海南捕鳥蛛和廣西大疣蛛的毒素進(jìn)行了較深入的研究。悅目金蛛Argiopeamoena隸屬于蜘蛛目園蛛科金蛛屬，體中大型，為結(jié)網(wǎng)蜘蛛，在我國(guó)南方各省均有分布，多出沒于夏秋季，以卵袋越冬［13］。由于悅目金蛛多生活在植被繁茂的山區(qū)，不易飼養(yǎng)，故關(guān)于悅目金蛛毒素的研究少有報(bào)道。
1儀器與材料
1.1儀器
上海精密A1004電子天平，OlympusCX41顯微攝像系統(tǒng)，上海新苗DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱和DHG-9073BS-Ⅲ恒溫鼓風(fēng)干燥箱，湖南星科TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)，江蘇昆山KQ-50DB數(shù)控超聲波清洗器，北京泰克0610-403體式顯微鏡，日本三豐560-108NK20游標(biāo)卡尺，上海光學(xué)顯微鏡測(cè)微尺和上海亞榮真空抽氣泵與干燥器等。
1.2悅目金蛛的采集
悅目金蛛采自于江西省貴溪市冷水林場(chǎng)，共28頭，其中雄性3頭，雌性25頭。悅目金蛛主要分布于山區(qū)丘陵地帶，布圓網(wǎng)于向陽(yáng)面，以捕食較大型昆蟲為主，喜結(jié)網(wǎng)于人居區(qū)周邊灌叢，尤以牛棚豬圈旁為多。悅目金蛛脆弱，附肢較長(zhǎng)，極易損傷，在采集過(guò)程當(dāng)中應(yīng)格外小心；可以用捕蟲網(wǎng)將蜘蛛捕獲，裝入盒內(nèi)，放入一些樹葉，以保持濕度和良好通風(fēng)性，避免振蕩和過(guò)度高溫。采集完畢返回后，應(yīng)將蜘蛛及時(shí)放在灌木上實(shí)行半開放式生態(tài)放養(yǎng)。
2結(jié)果與方法
2.1悅目金蛛毒腺形態(tài)與體量相關(guān)性分析
悅目金蛛的毒腺最細(xì)端位于螯基前端，并向頭部延伸，多位于頭胸部前段內(nèi)，覆蓋在神經(jīng)團(tuán)上，且左右兩兩相對(duì)趨向于蛛體的縱中軸。為了快速、準(zhǔn)確而高效地獲得蜘蛛毒腺，避免造成材料的損失，我們對(duì)悅目金蛛毒腺進(jìn)行了形態(tài)解剖，明確毒腺的結(jié)構(gòu)和具體位置，然后對(duì)毒腺進(jìn)行形態(tài)描述。解剖之前先用電子天平稱出蜘蛛的體重,對(duì)大型個(gè)體用游標(biāo)卡尺分別量出其頭胸部和腹部的長(zhǎng)和寬,而對(duì)小型蜘蛛個(gè)體則用顯微測(cè)微尺量出其頭胸部和腹部的長(zhǎng)和寬，隨后測(cè)量取出的毒腺長(zhǎng)和寬，并稱重。
具體測(cè)量結(jié)果見表1～2，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析表明：悅目金蛛在性別相同、生境一致、個(gè)體大小不同時(shí)，蜘蛛毒腺的位置和形態(tài)與蜘蛛的種群演化、生活方式和形態(tài)體積有一定關(guān)系，其中，成蛛的毒腺重量與其體質(zhì)量之間呈正相關(guān)，相關(guān)顯著；成體的毒腺長(zhǎng)度與其頭胸長(zhǎng)之間也為正相關(guān)，顯著性檢驗(yàn)為極顯著。表1悅目金蛛成體毒腺重量與個(gè)體質(zhì)量的相關(guān)性（略）表2悅目金蛛成體毒腺長(zhǎng)度和個(gè)體長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)相關(guān)性分析（略）
2.2悅目金蛛粗毒提取和制備方法的優(yōu)化
由于悅目金蛛與特大型虎紋捕鳥蛛、敬釗纓毛蛛等相比，成體相對(duì)較小，含毒量不多，且附肢長(zhǎng)，給采毒帶來(lái)困難；我們?cè)趪L試過(guò)活體誘導(dǎo)取毒、電刺激取毒和解剖分離毒腺等多種方法后，確定了采用毒腺解剖法，后經(jīng)多次比對(duì)試驗(yàn)，優(yōu)化出一條適于毒量不大蜘蛛毒腺的解剖勻漿取毒法，步驟如下：
先將蜘蛛放入冰箱-4℃凍暈，根據(jù)鰲肢確定毒腺管位置，然后從背面“丁字型”剪開其頭胸甲，依毒腺管向上延伸方向找到毒腺，并用鑷子小心取出，將其冰凍干燥保存。
取15對(duì)干燥毒腺，在2～3倍去離子水中制成勻漿，用2000r/min的速率離心15min，取上清液。向沉淀物中加等體積去離子水，再離心，取上清液。再向沉淀物中加等體積去離子水，調(diào)pH值至4.0，勻漿、離心、取上清液，合并上清液，過(guò)濾，去除雜質(zhì)，得到澄清液，進(jìn)行冷凍，等結(jié)成冰塊，將冷凍的蛛毒冰塊放置于真空干燥器內(nèi)，進(jìn)行真空干燥，在干燥器的底層放適量的氧化鈣作為干燥劑，接著用真空泵抽氣，抽氣過(guò)程中，要注意觀察，如果發(fā)現(xiàn)蛛毒表面產(chǎn)生大量氣泡時(shí)，就要停止片刻再抽，直至基本干燥，變成大小不等的顆粒結(jié)晶體為止，真空干燥一般在6h內(nèi)徹底干燥完。干燥后的蛛毒即成粉末狀或塊狀，刮下干毒粉分裝成小瓶，溶蠟密封，貼上標(biāo)簽，注明蛛毒毒粉的制備日期和重量，上包不透明的黑紙，置于-5℃的冰箱內(nèi)可保存1年不變質(zhì)。在整個(gè)取毒和制備過(guò)程中，應(yīng)首先注意整個(gè)過(guò)程必須潔凈衛(wèi)生，確保采毒的純度，其次取毒過(guò)程盡量在低溫下進(jìn)行，各種試劑必須預(yù)先冰浴。
2.3悅目金蛛粗毒組分和效價(jià)檢測(cè)
2.3.1悅目金蛛粗毒組分及結(jié)構(gòu)觀察
常溫下，提取制備到的悅目金蛛粗毒呈粉狀；用光學(xué)顯微鏡觀察粗毒，100和400倍下粗毒呈片狀或片狀均勻晶體，不含其它顆粒雜質(zhì)。見圖1。
2.3.2悅目金蛛粗毒的凝聚和裂解作用檢測(cè)
取50μl制備好的泰和烏雞血紅細(xì)胞懸液（懸液細(xì)胞密度約為1.04×103個(gè)/mm3）和200μlPBS緩沖液加入1ml的PVC離心管中，隨后加入50μl悅目金蛛毒液，振蕩，搖勻。豎置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔5min，用移液槍取20μl反應(yīng)液于單凹載玻片上，用顯微鏡觀察，并拍照。經(jīng)多次重復(fù)梯度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明悅目金蛛粗毒溶液對(duì)泰和烏雞血紅細(xì)胞有明顯的促凝集和裂解作用，由此可說(shuō)明粗毒中含有糖蛋白凝集素和磷酯酶成分，且它能介導(dǎo)紅細(xì)胞粘連和促進(jìn)細(xì)胞裂解。見圖2。
2.3.3悅目金蛛粗毒促離子通道成分的探索
分別在60μl制備好泰和烏雞血紅細(xì)胞懸液（懸液細(xì)胞密度約為1.04×103個(gè)/mm3）中加入相應(yīng)的0.17mol/LKCl和0.17mol/LCaCl2溶液，調(diào)配至1.5ml，分成3個(gè)對(duì)照組，前兩份分別加入20μl悅目金蛛毒液和20μl大腹園蛛毒液，另外一份加入20μlPBS緩沖液。設(shè)5min，30min，60min，120min和180min5個(gè)不同反應(yīng)時(shí)段，分段取液于血球計(jì)數(shù)板上，用顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。具體反應(yīng)結(jié)果見圖3～4。通過(guò)對(duì)圖的比對(duì)分析，可以得知：悅目金蛛毒素和大腹園蛛毒素均有促進(jìn)紅細(xì)胞溶血的作用，且大腹園蛛毒素的作用更為明顯。而且，毒素對(duì)紅細(xì)胞的裂解作用在鈣離子環(huán)境下要比鉀離子環(huán)境下更強(qiáng)。推測(cè)其原因可能是兩種粗毒中有鈣離子配體門通道的激活成分，致使鈣離子快速進(jìn)入紅細(xì)胞，加速溶血；另外，蛛毒中可能存在的磷脂酶裂解紅細(xì)胞質(zhì)膜也是其中原因之一。
3討論
目前，蛛毒的采集多為誘導(dǎo)法和電擊法，由于悅目金蛛個(gè)體相對(duì)較小，螯肢細(xì)短，活體采毒極為困難。本文在對(duì)悅目金蛛的生活習(xí)性和形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究的基礎(chǔ)上，用改良優(yōu)化的毒腺解剖勻漿法，成功提取制備了具有穩(wěn)定性質(zhì)和生理活性的粗毒5mg，為毒素的后續(xù)純化和研究奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明，利用毒腺解剖勻漿法能夠獲得最大量更高純度的蛛毒。在實(shí)體鏡下，用解剖剪剪開螯肢和頭胸甲取出毒囊，如用銀針刺破毒囊，而不用勻漿法，可進(jìn)一步避免非毒素蛋白的污染。用去離子水將毒液洗出，2000r/min離心5min取上清液，冷凍干燥，獲得的毒素在顯微鏡下可觀察到均勻的結(jié)晶體。通過(guò)蛛毒對(duì)雞血紅細(xì)胞的毒理反應(yīng)研究，初步確定了蛛毒當(dāng)中含有凝集素和磷脂酶兩種成分。除此之外，還發(fā)現(xiàn)在鈣離子環(huán)境下蛛毒對(duì)紅細(xì)胞的溶血和凝集作用更為劇烈，其原因可能是蛛毒中含有某種物質(zhì)作用于細(xì)胞質(zhì)膜上的鈣離子配體門通道，從而促使鈣離子快速進(jìn)入紅細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞膨脹溶血，或許蛛毒中的凝集素也是某種類鈣粘蛋白，在鈣離子激活后能促使紅細(xì)胞粘連或凝集，降低O2/CO2交換率，造成機(jī)體呼吸窘迫甚至死亡。新晨：
【參考文獻(xiàn)】
1］袁鳳輝,白濤,曹波,等.蜘蛛的藥用價(jià)值研究概況［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008,19(2):282.
［2］費(fèi)瑞,楊洋.蜘蛛毒素的研究概況及應(yīng)用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,30(6):994.
［3］王建輝,谷維娜.蜘蛛多肽毒素研究進(jìn)展［J］.蛛形學(xué)報(bào)，2002,11(2):99.
［4］羅育發(fā),顏亨梅.蜘蛛毒腺解剖的初步研究［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2003,12(2):132.
［5］黃仁槐,梁宋平.蜘蛛多肽神經(jīng)毒素研究新進(jìn)展［J］.生命科學(xué)研究，2000,4(2):1.
［6］MalcolmR.Brown,DavidD.Sheumack.Aminoacidsequenceofversutoxin,alethalneurotoxinfromthevenomofthefunnel-webspideratraxversutus［J］.Biochem.J.1988,250:401.
［7］Gray,M.R.Sutherland,S.K.Arthropodvenoms.Springer-Verlag,Berlin.1978：pp.121.