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作者：劉曉蘭陳鈺瑛劉惠娟

【摘要】目的：探討鼠血漿中尼莫地平血藥濃度的測(cè)定及其藥代動(dòng)力學(xué)，建立HPLC測(cè)定鼠血漿中尼莫地平含量的方法。方法：采用藥效——藥代統(tǒng)一模型，以及HPLC測(cè)定。結(jié)果：色譜柱為HyperilC18柱（4.6×200mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇——水（87︰13），流速1.0ml/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm。尼莫地平血漿在10～3200ng·ml－1范圍，具有良好線性關(guān)系，Y=691C＋415，R=0.9998，提取回收率90.4%～103.0%，方法回收率97.0%～105.3%。大鼠灌胃給藥10mg·kg－1，20mg·kg－1，40mg·kg－1。血藥濃度時(shí)間曲線符合一級(jí)吸收的二室模型，劑量與AUC，Tmax具有良好線性關(guān)系。結(jié)論：尼莫地平在大鼠體內(nèi)的處置屬于線性動(dòng)力學(xué)，藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)與劑量無(wú)關(guān)。本法穩(wěn)定簡(jiǎn)單、可靠，可用于尼莫地平血藥濃度分析及藥代動(dòng)力學(xué)研究。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法尼莫地平血濃度藥代動(dòng)力學(xué)

尼莫地平是一種臨床上治療腦血管疾病廣泛應(yīng)用的鈣離子拮抗劑。本實(shí)驗(yàn)探討采用高效液相色譜法測(cè)定鼠血漿中尼莫地平血藥濃度，建立HPLC測(cè)定鼠血漿中尼莫地平含量的方法及其藥代動(dòng)力學(xué)。

1材料和方法

1.1藥物、動(dòng)物和儀器藥品和試劑：尼莫地平某制藥廠生產(chǎn)，尼莫地平對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），甲醇色譜純，其他試劑為分析純。動(dòng)物：大鼠，體重200～250g，雌雄兼用，由省動(dòng)物中心提供，給藥前禁食過(guò)夜。儀器ShimadzuLC-10ADVP液相色譜儀，ShimadzuSPD-10A二極管陣列檢測(cè)器，Class-VP5.2色譜工作站，ShimadzuLC-6A液相色譜儀，Waters486可變波長(zhǎng)檢測(cè)，SR2000色譜數(shù)據(jù)工作站（上海三銳科技）。

1.2色譜條件色譜柱：大連依利特Hypersil-C18柱（4.6×200mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇——水（87︰13）；流速：1.0ml/min，柱溫：35℃。測(cè)定波長(zhǎng)240nm。

1.3對(duì)照品溶液的配制取經(jīng)五氧化二磷60℃真空干燥至恒重的尼莫地平對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定至100ml量瓶中，加氯仿1.5ml溶解，流動(dòng)相加至刻度，搖勻，即得濃度為100μg·ml－1的對(duì)照品溶液。精密量取0.1ml及2ml分別置10ml量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為1及20μg·ml－1的對(duì)照品溶液。

1.4大鼠血漿中尼莫地平含量的測(cè)定取大鼠血漿1ml加甲醇1ml，旋渦1min，加2mol·L－1碳酸鈉溶液100μL，旋渦1min，加環(huán)已烷4.5ml，旋渦提取3min，4000rmin－1離心10min，取上清液4ml置另一離心管中，40℃水浴中氮?dú)鈸]干，進(jìn)樣前用150μL甲醇溶解，進(jìn)樣50μL，外標(biāo)法以樣品峰面積計(jì)算生物樣品中尼莫地平濃度。

1.5給藥劑量選擇根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，大鼠顯效劑量為22.5mg·kg－1；急性毒性試驗(yàn)，灌胃給藥，LD50＞2.0g，故選定的試驗(yàn)試量為10，20，40mg·kg－1。

1.6大鼠藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用大鼠216只，雌雄各半，隨機(jī)分成3組，每組雌雄各半，實(shí)驗(yàn)10，20，40mg·kg－1三個(gè)劑組，取尼莫地平適量，精密稱(chēng)定，用0.5%羧甲基纖維素納配成混懸液，供大量ig給藥，給藥容量為2ml·100g－1。于給藥0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12，16，24，32h后不同時(shí)間大鼠股動(dòng)脈取血，肝素抗凝，離心分離出血漿，－18℃冰凍保存，每一時(shí)間點(diǎn)用6只大鼠，分別測(cè)定各鼠的血漿藥物濃度。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1按“尼莫地平血藥濃度測(cè)定方法”項(xiàng)下操作，色譜圖見(jiàn)圖1。尼莫地平的保留時(shí)間為8.4min，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖1A為空白，B為體外，C為體內(nèi)。

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)將大鼠ig給藥后不同時(shí)間取樣后多作的血漿混合作為穩(wěn)定性試驗(yàn)樣本，進(jìn)行以下試驗(yàn)：①樣品當(dāng)日提取測(cè)定作為基礎(chǔ)值，另將同日已提取揮干溶劑的殘?jiān)芾洳兀?℃）放置2天后測(cè)定。②樣品冷凍，-20℃放置，冷凍后第一次融化，取樣測(cè)定。③已融化過(guò)一次的樣品再冷凍放置，冷凍一周后第二次融化，取樣測(cè)定。結(jié)果表明：與基礎(chǔ)值比較，在3種樣品放置條件下，P＞0.05（α=0.02），說(shuō)明血樣處理吹干后，冷藏放置2天內(nèi)穩(wěn)定；含藥血漿冷凍放置較穩(wěn)定，冷凍后融化2次對(duì)樣品含量無(wú)影響。

2.3線性關(guān)系考察取離心管數(shù)支，精密加入不同量的尼莫地平對(duì)照品溶液，以空白血漿配成濃度為10、20、60、160、400、800、1600、3200ng·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿,按“大鼠血漿中藥物濃度測(cè)定”項(xiàng)下操作,每種濃度2份,記錄峰面積，以尼莫地平峰面積對(duì)濃度進(jìn)行加權(quán)回歸分析。結(jié)果表明尼莫地平在10～3200ng·ml-1范圍內(nèi)線性良好，10mg·kg-1劑量的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=591C+415,r=0.9998；20mg·kg-1劑量的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=606C+264,r=0.9997；40mg·kg-1劑量的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=608C+809,r=0.8887。

2.4提取回收率與方法回收率測(cè)定取離心管數(shù)支，精密加入尼莫地平不同量吹干溶劑，使含尼莫地平絕對(duì)量為60、400、3200ng,加甲醇150L溶解殘?jiān)M(jìn)樣分析，得峰面積As。另取空白血漿配成含尼莫地平60ng、400ng、3200ng·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿，按“大鼠血漿中尼莫地平濃度測(cè)定”項(xiàng)下操作，每種濃度5份，得血樣峰面積Ax，血樣提取物峰響應(yīng)值與甲醇配制的相同濃度的尼莫地平

直接進(jìn)樣峰面積比值(4.5Ax/4As×100%)即為提取回收率，將測(cè)得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度除以加入的濃度即為方法回收率。

2.5精密度試驗(yàn)按“線性關(guān)系考察”項(xiàng)下操作，配制濃度分別為60、400、3200ng·ml-1的尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)血漿進(jìn)行分析，在同日內(nèi)用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)儀器進(jìn)行分析，測(cè)定日內(nèi)精密度；于試驗(yàn)第1、2、3、4、5天，分別測(cè)定其日間精密度，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)。

2.6靈敏測(cè)定逐級(jí)降低加入血漿中尼莫地平量，測(cè)得尼莫地平在大鼠血漿中的最小檢測(cè)限I為5ng·ml-1。

3大鼠血藥濃度

測(cè)定大鼠ig三個(gè)劑量后血漿中不同血藥濃度，血藥濃度時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。將血藥濃度一時(shí)間數(shù)據(jù)分別采用3P97程序（中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理委員會(huì)編制）[1]按一級(jí)吸收的開(kāi)放一室模型，一級(jí)吸收的開(kāi)放二室模型，進(jìn)行模型擬合，判別指標(biāo)為1.Re=∑（Ci-Ci*）2；2.AIC=NlnRe+2m經(jīng)模型擬合,根據(jù)最小AIC準(zhǔn)則,選擇二室模型為好。

4討論

4.1大鼠血藥濃度方法建立時(shí)，發(fā)現(xiàn)在最大波長(zhǎng)231nm檢測(cè)，有來(lái)自溶劑中的較小的干擾，選擇240nm測(cè)定，干擾消失，雖靈敏度有所降低，但方法的靈敏度符合藥代動(dòng)力學(xué)要求，故最終240nm作為設(shè)定波長(zhǎng)。

4.2尼莫地平樣品處理直接沉淀法：分別以甲醇和乙腈做蛋白沉淀劑，提取回收率均在90%以上，但動(dòng)物預(yù)試驗(yàn)未能測(cè)出血藥濃度，表明本品血藥濃度低，樣品需采用液—液提取濃縮的方法處理。

4.3有機(jī)溶劑在藥物水溶液中的提取回收率結(jié)果表明：提取前應(yīng)先用2mol·L-1碳酸鈉溶液堿化，堿化后的回收率大于80%。

4.4沉淀試劑的選擇根據(jù)提取液揮發(fā)的難易及空白干擾情況，沉淀蛋白可使藥物釋放出來(lái)，選擇甲醇沉淀，環(huán)乙烷提取，提取液離心易分層，兩者對(duì)組織勻漿和糞便勻漿提取率均高且相當(dāng)，由于內(nèi)標(biāo)在此提取條件下回收率不穩(wěn)定，測(cè)定方法選用外標(biāo)法。

【參考文獻(xiàn)】

[1]衛(wèi)生部藥品審評(píng)辦公室，藥物制劑人體生物利用度試驗(yàn)指導(dǎo)原則[S]．中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，1992，8（3）：189～190．新晨