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【摘要】制備無定形磷酸鈣(ACP)負載重組人骨形態發生蛋白2(rhBMP2／ACP)納米緩釋體并觀察其細胞毒性，為進一步體內植入提供實驗依據。［方法］采用濕化學法合成rhBMP2／ACP納米緩釋體；兔間充質干細胞(BMSCs)與rhBMP2／ACP納米緩釋體進行體外復合培養，觀察細胞在材料表面的黏附、增殖及功能表達，檢測材料的細胞毒性。［結果］材料浸提液對兔BMSCs的生長無影響，其細胞相對增殖率在1002％～1025％之間，細胞毒性評級為0級；BMSCs于復合材料表面的黏附、生長速度、形態與對照組無明顯差別。［結論］rhBMP2／ACP納米緩釋體無細胞毒性，復合培養不影響BMSCs的正常生理功能，細胞相容性良好。

【關鍵詞】重組人骨形態發生蛋白-2無定形硫酸鈣細胞培養骨髓間充質干細胞細胞毒性

Abstract:［Objeetive］Todeveloptherecombinanthumanbonemorphogeneticprotein2(rhBMP2)loadedamorphouscalciumphosphate(ACP)delayedreleasenanosizedmaterial，investigateitscytotoxicityofcell，andprovideareferencefortheexperimentofcompositematerialinvivo．［Method］TherhBMP2／ACPdelayedreleasenanosizedmaterialwerepreparedbychemicalwetmethodandculturedonrabbitbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(BMSCs)invitro．Thentheadhesion，proliferation，growthandfunctionalexpressionofBMSCsweremeasured．［Result］CytotoxicitytestdemonstratedthatrhBMP2／ACPdelayedreleasenanosizedmaterialhadnotaffectthepercentageofcell’sproliferationwithmaterialextractedliquidculturedwithBMSCsandthecytotoxicitywasgradedzero．Theadhesion，proliferation，configurationofthecellsonthesurfaceofthismaterialwereidenticaltothecontrolgroup．［Conclusion］ItwassuggestedthatrhBMP2／ACPdelayedreleasenanosizedmaterialmighthavegoodcellularbiocompatibility,nocytotoxicityandnoteffectedthenormalfunctionalexpressionofBMSCsinvitro．

Keywords:rhBMP2；amorphouscalciumphosphate；cellculture；BMSCs；cytotoxicity

目前，骨修復替代材料的研究在生物取材、細胞的體外培養、支架材料復合體等諸多方面積聚了豐厚的基礎。無定形磷酸鈣(amorphouscalciumplosphate，ACP)是在采用濕化學法合成羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)時發現一種磷酸鈣的無定形中間相，是一類X射線衍射為非晶態的磷酸鈣材料的總稱，具有典型的無定形物質的球形面貌。研究發現ACP的骨傳導及細胞黏附性能優于HA〔1〕，生物降解速率高于磷酸三鈣〔2〕，可降解可任意塑形，其化學組分、磷酸鈣顆粒的表面形態、表面親水性等，能滿足藥物分子和人體細胞對載體的多重要求〔3〕，但ACP不具備誘導成骨能力、降解速率不易控制等缺點。作者采用ACP包裹重組人骨形態發生蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2，rhBMP2)，通過濕化學法合成技術，制備出rhBMP2／ACP納米緩釋體，以期發揮單一材料的原本優勢，克服ACP的劣勢和rhBMP2易被體液稀釋及蛋白酶分解不能充分發揮成骨誘導活性等不足，進一步提高材料的綜合性能。本研究在rhBMP2／ACP納米緩釋體研制等前期實驗的基礎上，觀察兔骨髓間充質干細胞(bonemarrowderivedmesenchymalstemcells，BMSCs)在材料表面的黏附、增殖及功能表達，評價其細胞毒性。

1材料和方法

11rhBMP2／ACP納米緩釋體的制備

在ACP原研技術條件下〔4〕，取適量K2HPO4、CaCl2分別溶于乙醇形成A、B液，rhBMP2溶于A液，于B液中添加適量有機物靜置過夜后，將A液緩慢滴加到B液中，在反應體系中加入01mol的NaOH以使pH保持在7左右，反應2h，經抽濾、洗滌，脫水干燥，獲得rhBMP2／ACP納米緩釋體。經X線衍射檢測成品表征為無定形相；掃描電鏡觀察納米顆粒均勻圓整，具有較好的球形形貌(圖1)。納米緩釋體中rhBMP2釋放起始量1d為(1399±166)％，呈現快速釋放，隨后則維持有效濃度持續緩慢釋放，30d時累積釋放量為(4576±460)％(圖2)，符合雙向動力學釋放規律。

12rhBMP2／ACP納米緩釋體的細胞毒性實驗

121實驗材料

1211主要試劑：DMEM培養液(美國Gibco)；胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶(美國Sigma)；MTT試劑(南京創瑞)；二甲基亞砜(DMSO，南京創瑞)；堿性磷酸酶試劑盒(ALP，南京建成)。

1212主要

儀器：倒置相差顯微鏡(德國Zeiss)；光學顯微鏡(日本Olympus)；掃描電鏡(日本Hitachi)；超凈臺(蘇州凈化儀器廠)；細胞培養箱(德國Herabus)；臺式高速普通離心機(德國Heraeus)；低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠)；酶標儀(美國BIORAD)；微量移液器(法國Gilson)；電熱恒溫水浴箱(上海醫用恒溫設備廠)。

122材料浸提液制備

取rhBMP2／ACP納米緩釋體實驗材料(以下簡稱實驗材料)的固相粉末3g，經60Co25kGy輻射滅菌后，浸入30ml浸體介質(含10％胎牛血清的DMEM培養液)中，置37℃、5％CO2、100％濕度孵育箱內靜置浸提，10d后取其上清液移入無菌玻璃容器內密封備用。

123材料試件制備

將濕化學法合成制備的實驗材料、對照材料(ACP由南京工業大學提供)預制成直徑2mm，厚度為3mm圓形標準試件，聚乙烯塑料袋雙層包裝，經60Co25kGy輻射滅菌后備用。

124實驗方法

1241BMSCs細胞的分離與培養取出生3d內的乳兔(南京金陵種兔場提供)，頸椎脫臼法處死后置于75％酒精中浸泡20min消毒，無菌條件下取雙側肱骨以及股骨，剔去肌肉組織，用含10％胎牛血清的DMEM培養液沖洗髓腔以及干骺端，以107個／ml的細胞密度接種于培養瓶中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱內培養，48h后棄去未貼壁的細胞，更換新鮮培養液，以后每3d更換一次培養液，細胞長到80％融合時，用025％的胰蛋白酶消化，按104個／cm2的細胞密度傳代培養，以第3代細胞作為實驗細胞。

1242細胞增殖率檢測(MTT法)將常規收集的第3代BMSCs，用025％胰酶消化計數后分為2組：實驗材料組加100％浸提液，對照組加DMEM培養液，每組復種8孔，置37℃、5％CO2、100％濕度孵育箱內靜置培養，倒置顯微鏡觀察細胞生長形態；于接種后2d、4d、6d和8d，分別進行MTT檢測：每孔加入MTT溶液20μl，培養4h后用移液器吸除孔內培養上清液，再于每孔內加入DMSO150μl，振蕩5min，待完全溶解后，置酶標儀500nm波長處測定各孔吸光光度值，各組所測結果取平均值，計算細胞相對增殖率(relativegrowthrate，RGR)。RGR=實驗組吸光度值／對照組吸光度值×100％。

1243細胞黏附率檢測將實驗材料試件置入培養板孔內，調整密度為5×105／ml的細胞懸液滴加到材料上，置孵育箱內培育4h，PBS緩沖液沖洗，去除未黏附的細胞，以025％的胰酶消化計數后計算細胞黏附率。黏附率=黏附細胞數／總細胞數×100％。設相同面積ACP材料作為對照。

1244細胞形態觀察將實驗材料試件安放于24孔培養板孔底，與1×105／ml密度的BMSCs直接接種于材料上，常規培養8d后取出試件，以3％戊二醛固定，PBS緩沖液漂洗3次，30%～100％梯度乙醇脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，表面噴金，掃描電鏡觀察。

1245ALP含量檢測取第3代BMSCs與實驗材料(ACP材料為對照)復合培養，分別于2d、4d和8d終止，棄去培養液，PBS緩沖液漂洗3次，每孔加入Tritonxl00細胞裂解液100μl，4℃24h充分裂解細胞，酶標儀450nm處測定各孔吸光度值，計算ALP含量。

125統計學方法

采用SPSS100統計軟件處理，數據用均數±標準差(±s)表示，單因素方差分析，P＞005為無顯著性差異。

2結果

21細胞相對增殖率(MTT法)

RGR實驗材料組為1002％～1025％，空白對照組為100％，兩組間無顯著性差異(P＞005)；兩組細胞毒性評級均為0級。表明實驗材料對兔BMSCs無細胞毒性(見表1)。

22細胞黏附率測定

BMSCs在實驗材料表面的黏附率為(838±86)％，對照組為(789±72)％，兩組間差異無統計學意義(P＞005)。

23細胞生長形態觀察

倒置相差顯微鏡下觀察：貼壁細胞胞膜完整，胞漿飽滿，胞核明顯，具有正常的細胞形態(圖3)。2d時實驗材料邊緣可見細胞附著生長，細胞多呈梭形，似成纖維細胞(圖4)。4d時細胞在材料完全鋪展，細胞形態為梭形、多角形，胞體伸出細長突起，生長趨勢良好。第8d細胞已鋪滿瓶底，呈多層集結，排列無規律。動態觀察中，未見細胞形態發生改變。傳代細胞形態與原代相似。掃描電鏡可見實驗材料表面及孔隙中有大量細胞黏附、增殖、生長，細胞呈梭形或多角形，并從胞體伸出數量不等、長短不

一、形態各異的突起，相互網絡，生長活躍(圖5、6)。表1MTT檢測結果及細胞毒性分級

測定時間點實驗組OD值(±s)RGR(%)毒性分級對照組OD值(±s)RGR(%)毒性分級2d0323±0023102500315±0023100004d0686±0025100400683±0020100006d0935±0022100200933±0021100008d1227±0025100201225±001910000圖1掃描電鏡下材料的形態圖圖2rhBMP2累積釋放曲線圖3倒置相差顯微鏡下觀察第3代BMSCs細胞形態圖4實驗材料與BMSCs共培養第2d細胞形態圖5、6掃描電鏡下實驗材料與BMSCs共培養第8d細胞形態(×400，×1500)24ALP含量測定

各時間點ALP含量見表2，2d時兩組ALP無明顯差別(P＞005)，隨培養時間的增加，實驗材料組明顯高于ACP材料組，兩組間差異有統計學意義(P<005)。表2兩組材料各時間點ALP含

3討論

理想的載體材料應具備與種子細胞的良好相容性、形狀的可塑性、易降解性和低抗原性等優點〔5〕。羥基磷灰石、磷酸三鈣和生物活性玻璃等無機高分子材料具備良好的材料組織界面，但材料脆性大，不易降解或降解速率難以控制，故應用受到限制。ACP是一種不同于羥基磷灰石和磷酸氫鈣的混合物，進程結構近似于磷灰石的Ca6(PO4)6團族和β相磷酸三鈣的Ca3(PO4)2團族〔6〕。以濕化學法合成制得的rhBMP2／ACP納米緩釋體，期望能優勢互補，充分利用ACP在生物礦化過程中顯現出的無定形物質各向同性的特點以賦予骨骼較高的力學性能，以及可降解、可任意塑形、通過改變組分進行調節〔1〕等特性和rbBMP2良好的誘導成骨作用〔7〕，尋求一種具有良好的生物活性、細胞黏附性、細胞相容性及可控的生物降解速率與新骨生成速率相匹配的骨修復替代材料。本實驗制備品經檢測納米緩釋體的物性、粒徑、表面形貌等保持了原材料的基本屬性。其負載的rhBMP2具有較好的體外釋放起始濃度，且能維持相應濃度持續緩釋，釋放規律與BMSCs向成骨細胞分化的時間相符，表明ACP球形納米微觀結構的高吸附性，能負載更多的活性因子，而表面微結構較低的粗糙度則能為細胞的黏附提供更多的附著點，為細胞行使功能建立適宜的框架基礎和代謝場所。ACP負載rhBMP2后，有效控制了外源性生長因子在局部持續有效濃度的釋放，并保持著良好的生物活性，發揮了rhBMP2誘導成骨的良好效能。復合培養結果顯示，實驗材料細胞黏附率、RGR及ALP測定指標與ACP材料相比均有不同程度提高，表明實驗材料較ACP材料更有利于細胞的黏附，并為細胞在其表面的生長、增殖及分泌基質提供了良好的微環境。

對生物材料進行細胞毒性試驗是檢測材料細胞相容性的基本內容，常以體內或體外方法檢測。體內植入法因受體內多種因素影響難以單獨反映生物材料與細胞的相容性，故本實驗選擇細胞體外復合培養法，通過直接觀測材料浸提液或材料表面種植細胞的形態變化與數量增減及功能表達等，可準確判定受試材料對細胞的毒性大小。作為對受試材料細胞毒性的初步評價，該方法具有簡便快捷、敏感直觀、重復性好等優點〔8〕。目前最為常用的MTT法，利用活細胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶將MTT還原成難溶的藍紫色甲瓚晶粒，而DMSO可溶解該結晶物顯色，通過檢測其吸光度值間接反映活細胞的生長、增殖等情況。本實驗采用兔骨髓取材便利，經分離液離心分層后，單核及有核細胞較易析出，分離培養簡單易行，BMSCs體外培養擴增后與實驗材料浸提液混合培養，MTT檢測能快速對材料的細胞毒性做出可靠的定量評定。細胞毒性通常隨溶出物濃度的增高而增大，本實驗應用浸提10d獲得的高濃度浸提液以便細胞毒性的顯現。實驗結果實驗材料對BMSCs增殖沒有影響，RGR＞100％，細胞毒性評級為0級，表明受試材料無細胞毒性；活細胞數量隨培養時間的延長逐漸增多，各時間點活細胞數實驗組高于對照組，說明受試材料對BMSCs的增殖有促進作用：直接接種于實驗材料表面的BMSCs黏附、增殖良好，生長形態、速度與對照組無明顯差別，進一步證明受試材料具有良好的細胞親和性。細胞與材料的黏附是細胞增殖和分化的基礎，ALP被認為是細胞外基質成熟的早期標志，在BMSCs體外成骨中促使基質礦化，可間接反映細胞的成骨活性。ALP活力是細胞早期分化的重要指標，本實驗ALP活性實驗組明顯優于對照組，表明實驗材料對BMSCs向成骨細胞的定向分化有良好的誘導作用，可能和骨誘導生長因子與適宜載體緩釋系統結合形成的微環境有關。

本研究通過實驗材料與活細胞體外接觸實驗證實，材料與BMSCs可良好黏附并使其增殖。不具有細胞毒性，ACP復合rhBMP2增高了細胞黏附率。增強了細胞ALP活性，緩釋系統的構建環境有利于種子細胞的生長和功能表達，表現出良好的細胞相容性，為進一步行rhBMP-2／ACP納米緩釋體體內植入提供了實驗依據。

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