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關(guān)鍵詞：黃磷；亞砷酸鈉；毒性；肝疾病；組織細(xì)胞化學(xué)；酶學(xué)；疾病模型，動(dòng)物；大鼠

在中毒性肝損害中線粒體作為毒物作用的“靶細(xì)胞器”，對(duì)各種毒物非常敏感，其生化功能首先受到干擾，最后導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞［1，2］。鎂ATP酶(Mg2+-ATPase)，單胺氧化酶(MAO)，琥珀酸脫氫酶(SDH)，細(xì)胞色素氧化酶(CO)作為線粒體內(nèi)外膜標(biāo)志酶，經(jīng)組織化學(xué)(組化)方法原位顯示酶的活性，并定量觀察中毒性肝損害時(shí)酶活性的動(dòng)態(tài)變化對(duì)評(píng)價(jià)毒物的毒理作用及各種毒物不同的作用特點(diǎn)具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)黃磷，亞砷酸鈉中毒大鼠肝臟上述酶的組化染色，利用圖像分析技術(shù)對(duì)肝小葉各區(qū)帶酶活性定量測(cè)定，并結(jié)合光鏡及電鏡下毒物結(jié)構(gòu)損害的特點(diǎn)［3］，探討黃磷和砷肝損害的酶學(xué)特點(diǎn)及其中毒機(jī)制。

1材料與方法

1.1試劑與儀器ATP二鈉鹽(中科院上海生化研究所)；丁二酸鈉(上海試劑一廠)；細(xì)胞色素C(Sigma公司)；鹽酸色氨(Serva公司)；氯化硝基四氮唑藍(lán)(上海前進(jìn)試劑廠)；二氨基聯(lián)苯胺(Sigma公司)；Histostat低溫冷凍切片機(jī)(美國(guó))；圖像分析儀(德國(guó))。

1.2動(dòng)物分組與染毒方式健康雄性大鼠90只，體重(267±32)g，常規(guī)飼養(yǎng)，隨機(jī)分為三組，每組30只。黃磷(P組)1.5mg/kg溶于芝麻油，亞砷酸鈉(As組)20mg/kg，溶于水；大鼠灌胃染毒，劑量為每100g體重0.2ml，每周三次，連續(xù)12周。對(duì)照組給予等體積的芝麻油。

1.3酶組化及圖像分析方法染毒后每2周各組隨機(jī)抽取大鼠5只，放血處死。取出肝臟立即在右肝正中切取5mm×5mm×3mm組織塊，“AO”低溫冷凍切片機(jī)在-15℃下切成10μm厚切片。繼而入新配制的孵育液作孵育等系列處理，甘油明膠封片。同時(shí)作去底物空白對(duì)照。Mg2+-ATPase，SDH，CO，MAO組化均采用經(jīng)典方法［4］，并經(jīng)本研究室改良。標(biāo)本次晨作圖像分析處理。在熒光屏直視下劃出肝小葉及其區(qū)帶。該圖像分析以光密度(OD)值表示染色的深線，光密度值大表示酶活性高。中央靜脈區(qū)參數(shù)為OD1，中間帶為OD2，周?chē)鷰镺D3，全小葉為ODt。各組選取第2，4，10，12周標(biāo)本5只，每一標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野。所得參數(shù)由計(jì)算機(jī)作統(tǒng)計(jì)處理，多樣本均數(shù)的兩兩比較用方差分析，方差不齊者用秩和檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Mg2+-ATPase的變化該酶活性主要位于肝小葉周?chē)鷰В磻?yīng)顆粒呈棕褐色點(diǎn)狀和線狀(封四圖1)。砷染毒早期(2～4周)，OD1酶活性增高(封四圖2)；黃磷組則各區(qū)帶酶活性下降(封四圖3)，其后(10～12周)兩組酶活性均下降。詳見(jiàn)附表。

與對(duì)照組同期比較：1)P＜0.05；P＜0.01

2.2SDH的變化對(duì)照組反應(yīng)為紫藍(lán)色甲顆粒，主要定位于肝小葉OD3，OD1相對(duì)較低，P，As染毒后，酶活性普遍下降(各時(shí)間組ODt與對(duì)照組比較，P＜0.05)，但OD1酶活性均無(wú)明顯影響(P＞0.05)。

2.3MAO的變化反應(yīng)物為紫色，對(duì)照組主要分布在周?chē)鷰А，As染毒后ODt和OD3下降明顯，但As組12周較10周酶活性增高(41.27±5.976vs35.17±9.254，P＜0.05)。

2.4CO的變化反應(yīng)物為棕色顆粒，對(duì)照組主要位于肝小葉周?chē)鷰В瑥闹醒霂У街車(chē)鷰富钚蕴荻冗f增。在染毒早期(2～4周)各區(qū)帶酶活性無(wú)明顯變化。P組10～12周OD3活性下降(P＜0.05～0.01)，As組12周OD1酶活性增高(40.42±8.607vs32.48±8.896)，P＜0.01)，其它區(qū)帶變化不明顯。

3討論

3.1肝小葉中酶活性的正常分布及意義經(jīng)典肝小葉作為一古老概念，由于光鏡下邊界清楚，現(xiàn)仍用于教學(xué)和科研中。“肝腺泡”的引入無(wú)疑對(duì)肝功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)解釋更為完善，對(duì)肝臟病理和毒理研究有重大意義［5］。將肝小葉分為三個(gè)區(qū)帶，基本上與肝腺泡結(jié)構(gòu)吻合。小葉中央帶相當(dāng)于6個(gè)單腺泡的第Ⅲ帶；周?chē)鷰喈?dāng)于6個(gè)單腺泡的第Ⅰ帶，只是門(mén)管區(qū)周?chē)讼倥?個(gè)帶的部分肝細(xì)胞。肝小葉周?chē)鷰Ъ写罅康木€粒體，其標(biāo)志酶含量極豐富，是生物氧化過(guò)程的主要場(chǎng)所；也最先接觸毒物。而中央帶富含混合功能氧化酶［6］，是藥物(毒物)代謝的場(chǎng)所，肝細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)條件差，最受到藥物(毒物)的損害。

3.2黃磷、砷對(duì)肝酶系統(tǒng)的損害特點(diǎn)及其機(jī)制Mg2+-ATPase活性主要分布在膽小管，其次為線粒體，核膜及質(zhì)膜。本組砷染毒2周，中央帶Mg2+-ATPase，活性增高，第4周更為明顯；10周開(kāi)始回落，12周酶活性下降明顯；而周?chē)鷰С掷m(xù)下降。光鏡下發(fā)現(xiàn)，2～4周中央帶肝細(xì)胞濁腫變性；電鏡下線粒體腫脹，嵴膜完整清晰，膽小管輕度擴(kuò)張，10周線粒體基底密度降低，部分膜破裂［3］。此時(shí)，光鏡下可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。提示砷中毒早期，膽小管及線粒體Mg2+-ATPase活性代償性增強(qiáng)。而砷中毒早期，砷的排泄除腎外，主要經(jīng)膽道由糞便排出，因此，Mg2+-ATPase活性增強(qiáng)可能是機(jī)體中毒早期的一種解毒機(jī)制。以后隨著膽小管和線粒體結(jié)構(gòu)的破壞、酶活性降低。黃磷對(duì)Mg2+-ATPase的損害無(wú)選擇性，各區(qū)帶酶活性下降程度大于砷組。光鏡下，2周即出現(xiàn)細(xì)胞脂變，10周出現(xiàn)小片狀壞死；電鏡下胞質(zhì)含有大量脂滴及次級(jí)溶酶體，部分線粒體膜破壞、嵴溶解［3］，說(shuō)明脂質(zhì)過(guò)氧化作用損害了線粒體及其它生物膜結(jié)構(gòu)。同樣，黃磷也使周?chē)鷰AO，SDH活性下降，與張弘［2］報(bào)道的酶學(xué)變化相吻合。

然而，黃磷和砷對(duì)中央帶SDH無(wú)明顯影響則可能是OD1區(qū)SDH分布量甚少或毒物對(duì)其不敏感之故。砷作為氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，對(duì)琥珀酸介導(dǎo)的呼吸無(wú)明顯影響［7］。砷組晚期MAO活性有回升則可能為細(xì)胞對(duì)砷產(chǎn)生耐受后酶活性部分恢復(fù)所致。黃磷組僅晚期外周帶CO活性下降，結(jié)合上述結(jié)構(gòu)改變，考慮為中毒早期CO對(duì)黃磷不敏感。砷中毒晚期中央帶CO活性增高，可能是砷干擾了線粒體氧化的“外途徑”，從而激活了“內(nèi)途徑”使CO活性增高以滿足ATP生成的需要［8］。

此外，從光鏡及酶組化發(fā)現(xiàn)：同一個(gè)體肝臟一定部位，中毒后不同的肝小葉其結(jié)構(gòu)及酶活性損害程度不同。同一小葉不同區(qū)帶其損害也不盡相同。電鏡下還觀察到，同一區(qū)帶內(nèi)不同的肝細(xì)胞其結(jié)構(gòu)損害差異亦很大。這種差異性，說(shuō)明了肝細(xì)胞生理功能與細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)在

聯(lián)系的復(fù)雜性，其組織學(xué)及病理學(xué)意義有待進(jìn)一步探討。

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