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【摘要】在合成培養(yǎng)基中利用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素。當(dāng)向培養(yǎng)基中加入生物素和氨基酸時(shí)，林可霉素的產(chǎn)量受到很大影響。本研究中首先采用兩水平因子設(shè)計(jì)法篩選出6個(gè)顯著影響因子，即生物素、谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸；然后采用中心組合設(shè)計(jì)法，得到上述6因子的優(yōu)化含量分別為30μg/L、100.5、83、29、117.5和58.5mg/L；最后在搖瓶中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化條件下發(fā)酵液的生物效價(jià)為2116μg/ml；對(duì)照樣品I(培養(yǎng)基中無生物素和氨基酸)和II(培養(yǎng)基中按原配方加入6個(gè)顯著影響因子)的生物效價(jià)分別為893和1481μg/ml，與樣品I和II比較，生物效價(jià)分別提高136.62%和42.88%。

【關(guān)鍵詞】林可鏈霉菌；林可霉素；發(fā)酵；生物合成；響應(yīng)面法

Effectsofbiotinandaminoacidsonbiosynthesisoflincomycin

LiXiao1,ChuJu1,ZhangSiliang1,HangHaifeng1,

ZhuangYingping1andGeYouqun2

(1StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237;

2JiangxiGuoyaoPharmaceuticalCo.,Ltd,Nanchang330052)

ABSTRACTStreptomyceslincolnensiswasutilizedtoproducelincomycinbyfermentationinchemicallydefinedmedium,enormouseffectontheyieldoflincomycinwouldoccurwhenbiotinandaminoacidswereaddedtothemedium.Inthisresearch,firstly,6significantfactorswerefoundwithtwolevelfactorialdesign,namelyDbiotin,Lglutamicacid,Lvaline,Lmethionine,LleucineandLtyrosine;secondly,theoptimizedingredientsof6factorsmentionalabovewereobtainedwithcentralcompositedesign,theywere30μg/Land100.5,83,29,117.5and58.5mg/Lrespectively;finally,verificationtestwasaccomplishedinshakingflasks,thetitreofthefermentedbrothwas2116μg/mlontheoptimizedconditions,butthetitresofthecontrolI(withoutDbiotinandaminoacidsinthemedium)andcontrolII(adding6significantfactorstomediumaccordingtooriginalingredients)were893μg/mland1481μg/mlrespectively,compairedwithcontrolIorII,increasedby136.62%and42.88%.

KEYWORDSStreptomyceslincolnensis;Lincomycin;Fermentation;Biosynthesis;Responsesurfacemethod

林可霉素是一種高效廣譜抗生素，臨床用于由抗革蘭陽性菌引起疾病的治療［1］。林可霉素A的分子式為C18H34N2O6S，分子量為406.56，它與林可霉素B在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別［2，3］為：林可霉素A4位上為正丙基，而林可霉素B4位上是乙基，兩者在藥理上存在著很大的區(qū)別，林可霉素B的抑菌活性比林可霉素A低，但對(duì)人的毒副作用較大。我國藥典要求成品中B含量小于5%。

林可霉素屬于林可胺類抗生素，由L酪氨酸和磷酸戊糖循環(huán)(戊糖5磷酸和景天糖7磷酸)的中間產(chǎn)物縮合而成，整個(gè)生物合成途徑包括兩個(gè)分支［4］：一個(gè)由L酪氨酸合成丙脯氨酸(PPL)，另一個(gè)由景天糖7磷酸構(gòu)成α甲硫林可胺(αMTL)。林可霉素A的推測(cè)生物合成途徑已有文獻(xiàn)報(bào)道［5］，并提出酪氨酸是上述第一個(gè)分支途徑的主要前體。

關(guān)于提高林可霉素產(chǎn)量的方法比較多，可在發(fā)酵液中加入前體［6］，也可用磷酸鹽對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行調(diào)節(jié)［7～10］。在實(shí)際的大生產(chǎn)中，常常采用少量多次補(bǔ)入玉米漿來實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的調(diào)節(jié)。玉米漿的主要成分為每100g干物質(zhì)中含生物素1mg、蛋白質(zhì)43g和結(jié)合氨基酸22.8g等，隨著玉米漿的補(bǔ)入，細(xì)菌中輔酶Q的合成量提高，細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度也增加［11］。

D型生物素是許多微生物必不可少的生長因子。生物素是乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酰CoA羧化酶和3甲基巴豆酰CoA羧化酶4種羧化酶的輔酶成分［12］，它對(duì)糖代謝、脂肪酸代謝及蛋白質(zhì)和氨基酸代謝有較大的影響。L型氨基酸對(duì)微生物的生長和代謝具有很重要的作用，它們一方面可經(jīng)過脫氨或轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)生成對(duì)微生物的生長有刺激作用的物質(zhì)，如分支脂肪酸，另一方面經(jīng)過脫羧等多步反應(yīng)生成丙酮酸、草酰乙酸、丙酰CoA及琥珀酰CoA等，對(duì)三羧酸循環(huán)有一定的強(qiáng)化作用［13，14］。

本文采用合成培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，選擇玉米漿中含量較豐富的D生物素、L谷

氨酸、L纈氨酸等15個(gè)因子首先進(jìn)行兩水平因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以篩選出顯著影響因子，然后進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，通過軟件分析得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

1材料與方法

1.1菌種

林可鏈霉菌(Streptomyceslincolnensis)L427，由江西國藥有限公司提供。

1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(%)淀粉1.9，葡萄糖2.5，黃豆餅粉2.3，玉米漿2.6，硫酸銨0.2，硝酸銨0.14，氯化鈉0.07，硝酸鈉0.086，磷酸二氫鉀0.005，碳酸鈣0.68。

玉米漿購自華北制藥康欣有限公司，批號(hào)20060701。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)葡萄糖3.0，硫酸銨0.1，硝酸銨0.2，氯化鈉0.05，磷酸氫二鉀0.25，檸檬酸鈉0.3，硫酸鋅0.0001，硫酸亞鐵0.0001，硫酸鎂0.15，碳酸鈣0.8。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所用D生物素和L型氨基酸購自Sigma公司。

1.3培養(yǎng)條件與培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)種子搖瓶于30℃，220r/min培養(yǎng)48h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)按30%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，220r/min，培養(yǎng)168h。

1.4生物效價(jià)的測(cè)定

采用管碟法［15］。鑒定菌為藤黃八疊球菌［Sarcinalutea，CMCC(B)28001］，由江西國藥有限責(zé)任公司提供。林可霉素(lincomycin)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。

2結(jié)果與討論

2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本文中發(fā)酵培養(yǎng)基采用化學(xué)合成培養(yǎng)基，通過兩水平因子設(shè)計(jì)(2LevelFactorialDesign)實(shí)驗(yàn)可迅速找出生物素和氨基酸中對(duì)林可霉素的發(fā)酵生產(chǎn)有顯著影響的因子，進(jìn)一步對(duì)顯著影響因子進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)(responsesurfacedesign，RSD)實(shí)驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析可得到優(yōu)化配方。所采用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析軟件為DesignExpert7.0［16］。

在大量實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用D生物素(A)、L谷氨酸(B)、L蘇氨酸(C)、L絲氨酸(D)、L纈氨酸(E)、L脯氨酸(F)、L甘氨酸(G)、L蛋氨酸(H)、L天冬氨酸(J)、L精氨酸(K)、L丙氨酸(L)、L亮氨酸(M)、L賴氨酸(N)、L苯丙氨酸(O)和L酪氨酸(P)共15個(gè)因子作兩水平因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，影響因子的濃度范圍分別為50～200μg/L，30～110、10～60、10～60、15～70、25～90、20～80、5～50、20～80、20～80、25～90、25～90、15～70、10～60和5～50mg/L，設(shè)計(jì)表中采用“-1”、“0”和“1”分別表示對(duì)應(yīng)影響因子的最低濃度值、中間濃度值和最高濃度值。

(1)兩水平因子設(shè)計(jì)該設(shè)計(jì)可從大量影響因子中快速找出顯著影響因子，設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表1所示。

用軟件進(jìn)行分析，得知設(shè)計(jì)模型的F值為18.05，由于噪聲影響而出現(xiàn)大于F值的概率僅為0.02%，故本設(shè)計(jì)模型是顯著的。A(D生物素)、B(L谷氨酸)、E(L纈氨酸)、H(L蛋氨酸)、M(L亮氨酸)和P(L酪氨酸)的F值分別為46.2、13.87、12.83、6.82、11.42和17.16，由于噪聲影響而出現(xiàn)比各自F值大的概率在5%以下，故它們對(duì)模型的影響顯著。曲率的F值為19.62，出現(xiàn)比F值大的幾率僅為0.16%，說明模型的響應(yīng)曲面圖顯著彎曲，提示模型具有很強(qiáng)的顯著性。鑒于此，選擇生物素、谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸作為影響發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的關(guān)鍵因素，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。其他可信度較小的因素對(duì)林可霉素的發(fā)酵生產(chǎn)無顯著影響，在下一步的培養(yǎng)基優(yōu)化中不予考慮。表1兩水平因子設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(2)響應(yīng)面設(shè)計(jì)將6個(gè)顯著影響因子進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)中的中心組合設(shè)計(jì)(centralcompositedesign，CCD)，可得出響應(yīng)值(生物效價(jià))關(guān)于各顯著影響因子的多項(xiàng)二次擬合方程，再對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行分析，可得響應(yīng)值與各因子之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，經(jīng)過綜合分析得出整個(gè)響應(yīng)區(qū)域中響應(yīng)值的最優(yōu)值和影響因子含量的最佳組合。

①中心組合設(shè)計(jì)6個(gè)顯著影響因子D生物素(a)、L谷氨酸(b)、L纈氨酸(c)、L蛋氨酸(d)、L亮氨酸(e)和L酪氨酸(f)的濃度范圍分別為30～100μg/L，90～190、30～130、20～120、40～1400和20～120mg/L。設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，“-1”、“0”和“1”分別表示對(duì)應(yīng)影響因子的最低濃度值、中間濃度值和最高濃度值。

方差分析結(jié)果如表3所示。該模型的F值為61.79，比F值大的幾率僅為0.01%，說明該模型是顯著的；由于ab、ad、ae、af、bc、cd、ce和ef各項(xiàng)的F值均比較大，大于各自F值的概率均在5%以下，故這些交互項(xiàng)對(duì)模型的影響是顯著的；ac項(xiàng)大于其F值的概率為5.22%，由于纈氨酸(c)在玉米漿中含量較多，它對(duì)微生物的生長有刺激作用，也可認(rèn)為ac項(xiàng)對(duì)模型的影響是顯著的；失擬項(xiàng)的F值僅為0.25，比模型的F值要小得多，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況不顯著，提示本設(shè)計(jì)模型能充分反映實(shí)際情況。表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3方差分析表

軟件分析得知，模型的擬合度(RSquared)為0.997，說明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性；校正決定系數(shù)(AdjRSquared)為0.9809，說明該模型能解釋98.09%響應(yīng)值(Titres)的變化,僅有總變異的1.91%不能用此模型來解釋；模型的信噪比(AdeqPrecision)為23.723，一般來說，模型的信噪比大于4就是較好的模型，進(jìn)一步說明本模型設(shè)計(jì)是非常成功的。

②分析與優(yōu)化利用軟件對(duì)生物效價(jià)預(yù)測(cè)值與顯著影響交互項(xiàng)ab、ac、ad、ae、af、bc、cd、ce、ef之間的響應(yīng)面圖進(jìn)行分析，得知上述交互作用項(xiàng)對(duì)生物效價(jià)的影響很大，在低濃度范圍內(nèi)，生物素濃度越低，生物效價(jià)的預(yù)測(cè)值越大；谷氨酸和纈氨酸之間、纈氨酸和亮氨酸之間以及亮氨酸和酪氨酸之間對(duì)生物效價(jià)的影響具有顯著的正協(xié)同效應(yīng)；纈氨酸和蛋氨酸對(duì)生物效價(jià)的影響存在拮抗效應(yīng)，纈氨酸濃度較高和蛋氨酸濃度較低時(shí)，預(yù)測(cè)效價(jià)值較高。

對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析可知，低濃度的生物素對(duì)林可鏈霉菌的糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝有促進(jìn)作用；林可鏈霉菌對(duì)谷氨酸的需求量較高，可能是因?yàn)槠鋮⑴c較多的脫氨基和轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成了較多的α酮戊二酸等中間產(chǎn)物，一方面對(duì)三羧酸循環(huán)有強(qiáng)化作用，另一方面可為林可霉素的生成提供豐富的中間產(chǎn)物；纈氨酸和亮氨酸為分支氨基酸，它們脫氨基可生成支鏈脂肪酸，對(duì)林可鏈霉菌的生長有刺激作用；酪氨酸為林可霉素A合成的前體，補(bǔ)入適量的前體，可提高林可霉素A的合成速率和產(chǎn)量；蛋氨酸為去甲基林可胺轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的甲基供體，它對(duì)林可霉素的合成速率可能具有較大的限制作用，而纈氨酸對(duì)林可霉素的生長具有刺激作用，菌體生長與林可霉素的合成在某種程度上說是一種相互制約的關(guān)系，這樣就表現(xiàn)為蛋氨酸和纈氨酸之間的拮抗作用，而且林可霉素的合成要求有較高的菌濃，故培養(yǎng)基中應(yīng)適當(dāng)增加纈氨酸的濃度，相應(yīng)適當(dāng)降低蛋氨酸的濃度。

應(yīng)用DesignExpert7.0軟件進(jìn)行優(yōu)化分析，得到生物效價(jià)的最大預(yù)測(cè)值為2275μg/ml，對(duì)應(yīng)的D生物素、L谷氨酸、L纈氨酸、L蛋氨酸、L亮氨酸和L酪氨酸的濃度為：30μg/L及100.5、83、29、117.5和58.5mg/L。由江西國藥廠林可鏈霉菌L427發(fā)酵得到的林可霉素產(chǎn)品中B組分含量很低，所以本研究未用HPLC測(cè)定B組分含量。

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的有效性，在搖瓶中同步進(jìn)行了優(yōu)化組、對(duì)照組I(培養(yǎng)基中無生物素和氨基酸)和對(duì)照組II(培養(yǎng)基中按原配方加入6個(gè)顯著影響因子)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

3結(jié)論

在化學(xué)合成培養(yǎng)基中用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素，通過兩水平因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)生物素和氨基酸組分進(jìn)行篩選，得出六個(gè)對(duì)生物效價(jià)有顯著影響的因子：D生物素、L谷氨酸、L纈氨酸、L蛋氨酸、L亮氨酸和L酪氨酸；通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和軟件的優(yōu)化分析表4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

a：發(fā)酵培養(yǎng)基配方為原始配方(材料與方法)與表4配方的組合；b：生物效價(jià)為每組3個(gè)平行樣的平均值。

得到上述六個(gè)顯著影響因子的含量分別為30μg/L及100.5、83、29、117.5和58.5mg/L時(shí)，最終發(fā)酵液的最大預(yù)測(cè)效價(jià)為2275μg/ml。

采用優(yōu)化配方進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)酵液的生物效價(jià)為2116μg/ml；而采用對(duì)照I和II配方進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)酵液的生物效價(jià)分別為893和1481μg/ml，即采用優(yōu)化配方相對(duì)于采用對(duì)照I和II配方在生物效價(jià)方面提高的百分含量分別為136.62%和42.88%。

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