本站小編為你精心準(zhǔn)備了扎那米韋長(zhǎng)鏈酯衍生物1c體內(nèi)外抗流感病毒活性參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

【摘要】目的研究扎那米韋長(zhǎng)鏈酯衍生物1c的體內(nèi)外抗流感病毒活性。方法體外實(shí)驗(yàn)以流感病毒感染的MDCK細(xì)胞為模型，以細(xì)胞病變?yōu)橹笜?biāo)，研究了化合物1c的細(xì)胞毒性以及對(duì)4種流感病毒A型和3種流感病毒B型的抑制活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用感染了流感病毒甲1(H1N1)亞型FM1株的小鼠動(dòng)物模型，觀察不同給藥方案、不同劑量、不同給藥途徑的多項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，化合物1c抑制流感病毒A型的IC50在0.23～26.86μmol/L之間；抑制流感病毒B型的IC50在21.79～246.80μmol/L之間。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用不同給藥方案1c治療可以明顯改善FM1感染小鼠的存活率，平均生活日及肺指數(shù)。結(jié)論化合物1c有潛能開發(fā)為抗流感病毒藥物。

【關(guān)鍵詞】扎那米韋；衍生物；流感病毒

ABSTRACTObjectiveTotesttheantiinfluenzavirusactivitiesofazanamivirderivative1c.MethodsThecytotoxicitiesandantiviralactivitiesof1cinvitroonfourinfluenzavirusAstrainsandthreeinfluenzavirusBstrainsweretestedinMDCKcells.Theantiviralactivitiesof1cinvivoweretestedinthemiceinfectedwithinfluenzaAvirussubtypeFM1.ResultsIncellculture,theIC50sof1cforinfluenzavirusAstrainswere0.23to26.86μmol/L,andforinfluenzavirusBstrainswere21.79to246.80μmol/L.Invivo,1cdisplayedsignificanttherapeuticaleffectsonmiceinfectedwithinfluenzavirusAsubtypeFM1onsurvivalrates,survivaldaysandlungindexeswithdifferentmedications.ConclusionThenewcompound1cmaybeapotentialcandidatefornewantiviraldrugs.

KEYWORDSZanamivir;Derivative;Influenzavirus

流感是一種由流感病毒引起的急性病毒性呼吸道傳染病，每年都在全世界流行，其波及范圍很廣，造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，對(duì)公共衛(wèi)生的威脅巨大［1，2］。盡管人們?cè)诜肿雍图?xì)胞水平對(duì)流感病毒的認(rèn)識(shí)有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是由于流感病毒抗原變異頻繁，疫苗效果不理想，藥物研發(fā)相對(duì)緩慢，所以流感病毒引起的死亡和損傷仍然是呼吸系統(tǒng)疾病中最為主要的［3～7］。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的流感病毒藥物研發(fā)分子靶點(diǎn)有：血凝素、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)、M2蛋白等，其中針對(duì)NA的研究最為廣泛和深入。通過在結(jié)構(gòu)水平對(duì)酶活力的研究，可以研制出構(gòu)效關(guān)系更明確、更加廣譜的抗病毒藥物［8～11］。FDA批準(zhǔn)的兩個(gè)NA抑制劑藥物扎那米韋和oseltamivir就是明顯的例子。由于扎那米韋的口服生物利用度低，分布體積較小，尿清除速率過快，所以臨床應(yīng)用受到限制，給藥途徑局限為吸入給藥［12］。一些實(shí)驗(yàn)室研究了扎那米韋類似物的合成以及它們對(duì)流感病毒的抑制活性［13～15］。

本研究中，我們對(duì)劉宗英等合成的扎那米韋長(zhǎng)鏈酯衍生物1c(結(jié)構(gòu)式見圖1)進(jìn)行了體內(nèi)外抗流感病毒活性研究。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們以MDCK細(xì)胞為模型，研究了化合物1c的細(xì)胞毒性以及對(duì)4種A型和3種B型流感病毒的抑制活性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以感染了流感病毒甲1(H1N1)亞型FM1株的小鼠為模型，評(píng)價(jià)化合物1c的體內(nèi)抗病毒活性。

圖1化合物1c的結(jié)構(gòu)式

1材料與方法

1.1材料

MDCK細(xì)胞由本室自行傳代培養(yǎng)。流感病毒A/粵防/243/72(H3N2)、流感病毒A/濟(jì)防/15/90(H3N2)、流感病毒A/京防/262/95(H1N1)、流感病毒A/漢防/359/95(H3N2)、流感病毒B/濟(jì)防/13/97、流感病毒B/京防/76/98、流感病毒B/四川/83/2000和流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株，H1N1)鼠肺適應(yīng)株均由本室提供。細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%新生牛血清，0.3mg/ml谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的Eagles基礎(chǔ)培養(yǎng)液(MEM)。維持液為含10%白蛋白，0.3mg/ml谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的Eagles基礎(chǔ)培養(yǎng)液(MEM)。小鼠為昆明鼠，雌、雄各半，14～16g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所?；衔?c和扎那米韋由本研究所合成室提供；利巴韋林(RBV)購(gòu)自湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究院。

1.2化合物1c對(duì)MDCK細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

(1)細(xì)胞病變法(CPE法)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞，按每孔約2.5×104MDCK細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入含有不同濃度倍比稀釋的1c的維持液，共8個(gè)稀釋度，每濃度2孔，同法測(cè)定扎那米韋，同時(shí)設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照。以觀察細(xì)胞病變?yōu)橹笜?biāo)，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，75%～100%為4，50%～74%為3，25%～49%為2，1%～24%為1，無(wú)病變?yōu)?。計(jì)算每濃度藥液平均細(xì)胞病變程度，按Reed&Muench法計(jì)算半數(shù)有毒濃度CC50。

(2)四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)&

nbsp;按每孔約2.5×104MDCK細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，24h后待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去培養(yǎng)液，加入含有不同濃度倍比稀釋的1c的維持液，每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72h，棄上清，加入100μl維持液配制的MTT(0.5mg/ml)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入100μl50%N，N二甲基甲酰胺(DMF)20%十二烷基磺酸鈉(SDS)脫色液，37℃過夜，在酶聯(lián)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570nm的吸收值(A570)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)定細(xì)胞對(duì)照孔3孔，結(jié)果以公式(細(xì)胞對(duì)照A570-加藥細(xì)胞A570)/細(xì)胞對(duì)照A570，計(jì)算細(xì)胞死亡率(%)，并用ReedMuench法計(jì)算半數(shù)有毒濃度CC50，同法測(cè)定扎那米韋。

1.3化合物1c體外抗流感病毒活性實(shí)驗(yàn)(CPE法)

按每孔約2.5×104MDCK細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，24h后待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去培養(yǎng)液，加入一定量的病毒，37℃吸附2h，然后棄病毒液，加無(wú)血清MEM洗板，加入含不同濃度化合物1c的維持液，每濃度3孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待病毒對(duì)照組病變?yōu)?個(gè)加號(hào)時(shí)，觀察結(jié)果。75%～100%為4，50%～74%為3，25%～49%為2，1%～24%為1，無(wú)病變?yōu)?。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照，病毒對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照藥為扎那米韋。并用ReedMuench法計(jì)算半數(shù)有效濃度IC50(表1)。

1.4化合物1c小鼠體內(nèi)抗流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株)療效實(shí)驗(yàn)

1.4.1預(yù)防+治療實(shí)驗(yàn)采用流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株)感染方法。除毒性對(duì)照組外，其余各實(shí)驗(yàn)組小鼠均經(jīng)乙醚麻醉，用加樣器經(jīng)鼻滴入40μl一定量LD50的實(shí)驗(yàn)病毒液。實(shí)驗(yàn)時(shí)化合物1c用5%吐溫80配成一系列濃度的懸液，采取灌胃方式給藥。劑量為31.25、15.63及7.81mg/kg。感染當(dāng)天在感染前4h灌胃給藥1次，感染后間隔4h再次給藥，每日2次，共5d。陽(yáng)性藥物RBV采用腹腔注射50mg/kg，每日2次，共5d。病毒對(duì)照組采用給予同樣體積5%吐溫80表1化合物1c體外抗流感病毒活性溶液灌胃給藥，每日2次，共5d。按所有給藥方式的最高劑量另設(shè)藥物毒性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)同時(shí)滴定病毒LD50。

1.4.2治療實(shí)驗(yàn)本次實(shí)驗(yàn)感染流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株)的方法同上。實(shí)驗(yàn)時(shí)化合物1c用5%吐溫80配成一系列濃度的懸液，采取灌胃和腹腔注射兩種方式給藥。灌胃劑量為62.5、31.25及15.63mg/kg；腹腔注射劑量為31.25mg/kg。感染當(dāng)天在感染后2h內(nèi)灌胃或腹腔注射給藥1次，間隔4h再次給藥，每日2次，共5d。其余操作均同上。

1.4.3判斷指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)分組

(1)死亡率及平均生活日

預(yù)防+治療實(shí)驗(yàn)組每組10只小鼠，共6組［31.25mg/kg，15.63mg/kg，7.81mg/kg，RBV，病毒對(duì)照(5%的吐溫80)，正常對(duì)照］。每日觀察并記錄每組死亡只數(shù)，共2周，用χ2檢驗(yàn)比較死亡率，用KaplanMeier法分析平均生活日。

治療實(shí)驗(yàn)組每組10只小鼠，共7組［62.5mg/kg，31.25mg/kg，15.63mg/kg，31.25mg/kg(腹腔注射)，RBV，病毒對(duì)照(5%的吐溫80)，正常對(duì)照］。每日觀察并記錄每組死亡只數(shù)，共2周，同法統(tǒng)計(jì)死亡率和平均生活日。

(2)肺病變、肺指數(shù)

預(yù)防+治療實(shí)驗(yàn)組每組8只小鼠，共6組［31.25mg/kg，15.63mg/kg，7.81mg/kg，RBV，病毒對(duì)照(5%的吐溫80)，正常對(duì)照］。感染后第4晚小鼠禁食，次日(即感染后5d)分組處死小鼠，取出鼠肺，肉眼判斷肺病變程度。0表示無(wú)肺病變，1～4為每級(jí)遞增25%的肺病變。每只小鼠稱體重(g)和肺重(g)，計(jì)算每只小鼠的肺指數(shù)(肺指數(shù)=肺重/鼠重)，用t檢驗(yàn)分析法比較肺指數(shù)，用Ridit分析法比較肺病變。

治療實(shí)驗(yàn)組每組8只小鼠，共7組［62.5mg/kg，31.25mg/kg，15.63mg/kg和31.25mg/kg(腹腔注射)，RBV，病毒對(duì)照(5%的吐溫80)，正常對(duì)照］。實(shí)驗(yàn)操作、判斷指標(biāo)的計(jì)算以及統(tǒng)計(jì)分析的方法同上。

(3)鼠肺TCID50滴定

預(yù)防+治療實(shí)驗(yàn)組每組20只小鼠，3組［31.25mg/kg，RBV，病毒對(duì)照(5%的吐溫80)］。在感染后d1、d2和d4分別從每組中取5只小鼠解剖，無(wú)菌取肺，在低溫和無(wú)菌條件下分別按每個(gè)鼠肺加入10倍體積的細(xì)胞維持液，乳缽研磨，獲得勻漿，冷凍離心，轉(zhuǎn)速10000r/min。離心后取上清，得到鼠肺的10-1液，再以細(xì)胞維持液作10倍稀釋，分別獲得每個(gè)鼠肺的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10液。在MDCK細(xì)胞中滴定上述鼠肺懸液的TCID50值，計(jì)算每組鼠肺每日平均TCID50值，作出曲線圖。

治療實(shí)驗(yàn)組每組20只小鼠，4組［31.25mg/kg，31.25mg/kg(腹腔注射)，RBV，病毒對(duì)照(5%的吐溫80)］。實(shí)驗(yàn)操作、判斷指標(biāo)的計(jì)算以及統(tǒng)計(jì)分析的方法同上。

(4)LD50測(cè)定兩種給藥方案操作相同，均為每組5只小鼠，共5組(10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)，每日觀察，記錄各組死亡只數(shù)，并用ReedMuench法計(jì)算半數(shù)致死濃度LD50。

2結(jié)果

2.1化合物1c的細(xì)胞毒性及體外抑制流感病毒實(shí)驗(yàn)

化合物1c在MDCK細(xì)胞中抗流感病毒A型和流感病毒B型的活性以及對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性結(jié)果見表1，陽(yáng)性對(duì)照藥為扎那米韋。

表1數(shù)值顯示化合物1c對(duì)流感病毒A型、流感病毒B型不同株的

抑制活性差別較大，扎那米韋也顯示同樣情況；1c對(duì)流感病毒A型的抑制活性雖不及扎那米韋，但對(duì)流感病毒B型的抑制活性明顯高于扎那米韋?；衔?c以及扎那米韋對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性測(cè)試結(jié)果為：化合物1c的CC50值大于318.05μmol/L，扎那米韋的CC50值大于1.50×104μmol/L。

2.2化合物1c體內(nèi)抗流感病毒活性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表2。

(1)預(yù)防+治療給藥方案表2數(shù)據(jù)顯示，31.25mg/kg組的4項(xiàng)判斷指標(biāo)與病毒對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；15.63和7.81mg/kg組與病毒對(duì)照組相比均顯示療效，在平均生活日指標(biāo)上有統(tǒng)計(jì)意義的差別。

(2)治療給藥方案本次實(shí)驗(yàn)除感染方案不同外，還增加了1c的劑量，觀察小鼠對(duì)1c的耐受情況，并增加一組1c的腹腔給藥，與灌胃給藥組在同等劑量下，觀察療效有無(wú)差別。表2結(jié)果顯示1c灌胃各劑量組各指標(biāo)間呈量效關(guān)系，同為31.25mg/kg，腹腔注射組的療效優(yōu)于灌胃給藥組，其療效相當(dāng)于62.5mg/kg灌胃組，在肺病變及肺指數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)上甚至優(yōu)于62.5mg/kg灌胃組。小鼠對(duì)62.5mg/kg藥量耐受良好，在實(shí)驗(yàn)期間，藥物毒性對(duì)照組體重增長(zhǎng)情況與正常對(duì)照組相似，未見毒性反應(yīng)(具體數(shù)據(jù)未列出)。

圖2列出治療給藥方案各組的肺病變照片；預(yù)防+治療給藥方案各組肺病變照片結(jié)果相似，未列出。

(3)治療給藥方案中鼠肺病毒分離情況圖3顯示治療給藥方案各組［31.25mg/kg，31.25mg/kg(腹腔注射)，RBV及病毒對(duì)照組］的鼠肺病毒分離及毒力圖2治療實(shí)驗(yàn)中各組肺病變圖圖3小鼠肺內(nèi)流感病毒滴度曲線測(cè)定(TCID50)結(jié)果。感染后d1，4組鼠肺TCID50相近，d2各組之間病毒TCID50分別為107.6/ml、107.1/ml、106.4/ml以及108.3/ml；d4病毒TCID50分別107.6/ml、106.9/ml、105.1/ml及107.2/ml。1c腹腔注射組病毒滴度降低比灌胃組更明顯，與其它指標(biāo)相一致，RBV降低病毒滴度最明顯。

預(yù)防+治療方案各組(31.25mg/kg，RBV及病毒對(duì)照組)的鼠肺病毒分離及毒力測(cè)定TCID50結(jié)果與治療方案組相似，未列出。

3討論

對(duì)化合物1c進(jìn)行的體內(nèi)、外抗流感病毒活性研究結(jié)果顯示，1c具有廣譜抗流感病毒活性，且作用機(jī)制與金剛烷胺類抗病毒藥物不同。體外實(shí)驗(yàn)中，1c對(duì)流感病毒A型各株的抑制活性雖不如扎那米韋，但1c對(duì)流感病毒B型的抑制活性明顯優(yōu)于扎那米韋。在流感流行，病原診斷不明確時(shí)，1c有優(yōu)勢(shì)。在感染了流感病毒甲1(H1N1)亞型(FM1株)的小鼠模型中，兩種給藥方案均顯示可重復(fù)的療效，并有量效關(guān)系。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1c腹腔注射途徑，藥物吸收較灌胃佳。由于1c可口服或注射給藥，而扎那米韋僅能局部噴藥，并需特殊給藥裝置，所以1c有一定的實(shí)用前景。原設(shè)計(jì)將oseltamivir作為陽(yáng)性對(duì)照藥，比較1c與oseltamivir在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的療效，但遺憾的是暫時(shí)無(wú)法獲得oseltamivir，我們正在積極尋求，以期解決上述表2化合物1c體內(nèi)抗流感病毒甲1(H1N1)亞型小鼠感染作用治療方案及感染病毒量*：P<0.05；**：P<0.01。問題。

對(duì)1c抗流感病毒的作用機(jī)制研究，我們?cè)醪綔y(cè)定1c抗流感病毒A型粵防243/72株NA活性，發(fā)現(xiàn)1c對(duì)NA的IC50為42.0nmol/L，活性明顯低于扎那米韋0.26～0.72nmol/L。文獻(xiàn)報(bào)道扎那米韋對(duì)流感病毒A型不同株NA的IC50值分布范圍較廣，為0.3～5.99nmol/L［16，17］。有關(guān)1c的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。1c為我國(guó)自行研發(fā)的全新化合物，有專利保護(hù)。鑒于1c體內(nèi)、外抗流感病毒的活性，有開發(fā)為抗流感病毒藥物的潛能。

致謝：感謝本研究室董飚碩士及章天主管技師對(duì)本工作的協(xié)助與支持。

【參考文獻(xiàn)】

［1］于淑娟.國(guó)內(nèi)外抗流感藥物開發(fā)應(yīng)用新進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2006，19(2)：133～134.

［2］恭曉明，許激揚(yáng)，丁玉林.抗流感病毒新藥神經(jīng)氨酸酶抑制劑［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2002，26(5)：266～270.

［3］李卓榮，劉宗英，湯雁波.抗流感病毒的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2002，23(4)：151～154.

［4］劉頌，王京燕.抗流感病毒藥物研究的進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè)，2005，32(2)：111～115

［5］ChandP,KotianPL,DehghaniA,etal.Systematicstructurebaseddesignandstereoselectivesynthesisofnovelmultisubstitutedcyclopentanederivativeswithpotentantiinfluenzaactivity［J］.JMedChem,2001,44(25):4379～4392.

［6］WangGT,ChenY,WangS,etal.Design,synthesis,andstructuralanalysisofinfluenzaneuraminidaseinhibitorscontainingpyrrolidinecores［J］.JMedChem,2001,44(8):1192～1201.

［7］MendelDB,TaiCY,EscarpePA,etal.Oraladministrationofaprodrugoft

heinfluenzavirusneuraminidaseinhibitorGS4071protectsmiceandferretsagainstinfluenzainfection［J］.AntimicrobAgentsChemother,1998,42(3):640～646.

［8］McKimmBreschkinJL.Neuraminidaseinhibitorsforthetreatmentandpreventionofinfluenza［J］.ExpOpinPharmacother,2002,3(2):103～112.

［9］HanessianS,WangJ,MontgomeryD,etal.Design,synthesis,andneuraminidaseinhibitoryactivityofGS4071analoguesthatutilizeanovelhydrophobicparadigm［J］.BioorgMedChemLett,2002,12(23):3425～3429.

［10］StollV,StewartKD,MaringCJ,etal.Influenzaneuraminidaseinhibitors:structurebaseddesignofanovelinhibitorseries［J］.Biochemistry,2003,3(7):718～727.

［11］YiX,GuoZR,ChuFM.Studyonmolecularmechanismand3DQSARofinfluenzaneuraminidaseinhibitors［J］.BioorgMedChem,2003,11(6428):1465～1474.

［12］VonItzsteinM,WuWY,KokGB,etal.Rationaldesignofpotentsialidasebasedinhibitorsofinfluenzavirusreplication［J］.Nature,1993,363:418～423.

［13］MasudaT,ShibuyaS,AraiM,etal.Synthesisandantiinfluenzaevaluationoforallyactivebicyclicetherderivativesrelatedtozanamivir［J］.BioorgMedChemLett,2003,13(4):669～673.

［14］HondaT,MasudaT,YoshidaS,etal.Synthesisandantiinfluenzavirusactivityof7Oalkylatedderivativesrelatedtozanamivir［J］.BioorgMedChemLett,2002,12(15):1925～1928.

［15］HondaT,MasudaT,YoshidaS,etal.Synthesisandantiinfluenzavirusactivityof4guanidino7substitutedNeu5Ac2enderivatives［J］.BioorgMedChemLett,2002,12(15):1921～1924.

［16］HurtAC,BarrIG,HartelG,etal.SusceptibilityofhumaninfluenzavirusesfromAustralasiaandSouthEastAsiatotheneuraminidaseinhibitorszanamivirandoseltamivir［J］.AntiviralRes,2004,62(1):37～45.

［17］MunqallBA,XuX,KlimovA.Surveillanceofinfluenzaisolatesforsusceptibilitytoneuraminidaseinhibitorsduringthe2000～2002influenzaseasons［J］.VirusRes,2004,103(2):195～197.新晨