本站小編為你精心準備了pten基因重組腺病毒對卵巢癌細胞生長抑制作用參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

作者：林觀平,熊亮,李樹梅,黃秀蘭,周克元

【摘要】目的:觀察攜帶野生型pten基因的重組腺病毒(Adpten)體外轉染高轉移卵巢癌HO8910PM細胞后的表達，并研究其對卵巢癌細胞抑制增殖、誘導凋亡和抑制遷移的作用.方法:利用AdEasy腺病毒載體系統構建Adpten，體外轉染高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，熒光顯微鏡檢測Adpten的轉染效率.Western印跡檢測pten在HO8910PM細胞中的表達；MTT實驗觀察pten對細胞生長的影響；HE染色法觀察外源性pten基因表達對細胞形態學的影響；細胞劃痕實驗觀察pten對細胞遷移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色檢測pten基因對HO8910PM細胞凋亡的誘導作用.結果:外源性野生型pten基因經腺病毒介導成功轉入HO8910PM細胞，Western印跡檢測出有PTEN蛋白的表達，當感染復數MOI為100時，體外轉染效率高達90%以上.pten顯著抑制HO8910PM細胞增殖、誘導其凋亡并能抑制其遷移.結論:重組腺病毒是高效的基因轉移系統，能將pten目的基因高效地轉移到高轉移卵巢癌HO8910PM細胞中，對細胞產生強有力的生長抑制及凋亡誘導作用，并能抑制其遷移.

【關鍵詞】卵巢腫瘤；基因治療；pten基因；腺病毒；細胞凋亡；遷移抑制

0引言

抑癌基因pten，即第10號染色體缺失的與張力蛋白同源的基因，是繼p53后又一個與多種腫瘤發生發展密切相關的抑癌基因，其編碼具有雙重特異磷酸酶活性的蛋白，可以反向調控磷脂酰肌醇(3)激酶（phosphatidylinositol3kinase，PI3K）/AKt信號傳導途徑，從而抑制細胞生長增殖.其突變和缺失多發于乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌等［1-3］.在某些pten基因突變或缺失的癌細胞中過表達PTEN蛋白能抑制細胞增殖和腫瘤的形成，使其細胞周期停滯在G1期并發生細胞凋亡［4-5］，而且在某些沒有pten基因突變的癌細胞中,使pten基因過表達也能抑制這些癌細胞生長，誘導其發生凋亡［6］；另外，pten基因還能抑制癌細胞的侵潤轉移，降低其遷移能力.這就提示pten基因用于癌癥基因治療有著重要意義.而基因治療載體的選擇最為重要，當今運用最多最廣泛的就是腺病毒(adenovirus,Ad)載體，其具有在哺乳動物及其他多種生物細胞上進行基因轉移和蛋白表達的高效性和不整合宿主細胞的性質，是一種比較安全，轉染效率又高的載體［7］.本研究采用攜帶野生型pten基因的重組腺病毒(Adpten)，將pten基因導入人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，觀察其在卵巢癌細胞中的表達，研究其對卵巢癌細胞生長抑制、遷移抑制、誘導凋亡的作用，對卵巢癌的基因治療進行初步的探索并提供有意義的參考數據.

1材料和方法

1.1材料人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞和人胚腎細胞293T購自中國科學院上海細胞生物學研究所；野生型pten表達質粒（wtpten）為美國加州大學FrankFurnari教授惠贈；AdEasy腺病毒表達載體系統由美國休斯霍華德醫學院及JohnHopkins腫瘤中心BertVogelstein教授惠贈，其中穿梭載體pAdTrackCMV帶有綠色熒光蛋白報告基因(gfp)，在表達外源基因同時也能單獨表達gfp，用于重組腺病毒的快速篩選以及轉染率的測定；抗PTEN抗體為美國SantaCruz公司產品;HRP標記羊抗鼠IgG抗體和馬抗山羊IgG均購自北京生物技術有限公司；MTT為美國Amerson公司產品.Hoechst33258細胞凋亡染色試劑盒購于武漢碧云天生物技術公司.

1.2方法

1.2.1重組腺病毒載體的構建及細胞培養應用細菌內同源重組的方法，構建攜帶野生型pten基因的重組腺病毒Adpten及陰性對照Adgfp［8］.HO8910PM細胞培養于含100mL/L小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養液中，置50mL/LCO2,37℃孵箱培養.

1.2.2Adpten轉染效率的測定取指數生長期的高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，以5×104/孔接種于6孔培養板中，24h后吸棄培養基，換無血清RPMI1640培養基，用25，50，100感染復數(multiplicityofinfection,MOI=病毒顆粒數/轉染的細胞數)的腺病毒感染,培養6h后，換完全培養液繼續培養.24h后在熒光顯微鏡下計數gfp陽性細胞百分率.確定HO8910PM細胞轉染所需的MOI值，使得轉染效率＞90%.

1.2.3WesternBlot檢測轉染細胞表達的PTEN蛋白取對數生長期細胞，按2×106接種于25cm2培養瓶中.常規條件培養24h后，按MOI=100加入病毒，設Adpten組和Adgfp組，培養6h后，換完全培養液繼續培養.48h后提取細胞總蛋白；以Bradford酶標儀蛋白定量法測定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12g/L），于4℃冰箱中90mA恒流電轉過夜，使目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上,封閉液于4℃封閉過夜，將膜轉至新的封袋中，按0.1mL/cm2加入適量的一抗稀釋液（小鼠抗人PTEN單抗按1∶300封閉液稀釋，山羊抗人Actin多抗按1∶500封閉液稀釋），封口后，室溫下平緩搖動反應4h.TBS洗滌后加入二抗稀釋液（PTEN,Actin的二抗均按1∶2000封閉液稀釋），同條件反應1h.大量TBS洗滌去除未結合的二抗.ECL（化學發光）處理，暗箱中以X光膠片曝光，顯影、定影.

1.2.4MTT法測定HO8910PM細胞增殖抑制率取對數生長期細胞，以5×103/孔接種于96孔板培養，常規條件培養24h后，吸棄培養基，換無血清RPMI1640培養基，按MOI=100加入病毒，設Adpten組，Adgfp組，PBS空白對照組和本底對照組(只加完全培養液，不種細胞)，培養6h后，換完全培養液繼續培養.每個

時間點設6個平行孔，在指定時間(24,48,72h)加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，孵育4h后，小心吸棄孔內上清液，加入DMSO150μL/孔，振蕩10min，490nm作為測定波長，570nm作為參比波長，在酶標儀上測定各孔的光吸收值.細胞增殖抑制率=［1-實驗組（A570nm-A490nm）/本底對照組（A570nm-A490nm）］×100%.

1.2.5HE染色觀察細胞形態取指數生長期高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，以5×104接種于35mm培養皿中，24h貼壁后，加入Adpten或Adgfp感染，并設加PBS為空白對照；病毒感染方法同1.2.4，24h后棄培養基，生理鹽水漂洗，950mL/L乙醇固定15min，蘇木素染色3～10min，自來水沖洗5～8min，5～10mL/L鹽酸酒精分化數分鐘，自來水沖洗5～8min，然后加溫熱水5～10min顯藍，自來水充分沖洗，伊紅復染2min，再次用自來水充分沖洗，普通光學顯微鏡下觀察.

1.2.6細胞劃痕試驗取指數生長期高轉移卵巢癌HO8910PM細胞，按2×104/孔接種于6孔培養板，用RPMI1640完全培養基孵育24h后，用移液槍槍尖在細胞培養基表面劃一條痕跡（長約2cm），用PBS洗3次后加入無血清RPMI1640培養基，病毒感染方法同1.2.4，設加PBS為空白對照，繼續培養48h后鏡下觀察.

1.2.7Hoechst33258凋亡染色取對數生長期HO8910PM細胞2×104/孔接種于6孔板，病毒感染方法同1.2.4，設加PBS為空白對照，48h后用固定液固定10min，PBS洗2次，Hoechst33258染色5min，熒光顯微鏡下觀察.

統計學處理:本實驗采用SAS8.0統計軟件進行統計分析，用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異有統計學意義.

2結果

2.1Adpten對HO8910PM細胞體外轉染效率的測定Adpten在體外感染人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞具有較高的轉染效率.在MOI=100時可以達到90%以上（圖1）.

A:熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達;B:同一視野下光學顯微鏡觀察.

圖1Adpten(MOI=100)感染HO8910PM細胞的效果×200

2.2Western檢測轉染后PTEN蛋白的表達Western印跡分析結果表明，Adgfp感染后的HO8910PM細胞未見特異性條帶；而Adpten感染后的HO8910PM細胞，則見到特異性條帶，而且Pten蛋白表達量也較高（圖2）.

圖2WesternBlot檢測PTEN蛋白的表達

2.3Adpten對HO8910PM細胞增殖的影響以MOI=100病毒感染后24，48，72h，通過吸光度值計算，Adpten的抑制率分別為(89.76±1.49)%,(91.11±1.38)%,(92.38±1.78)%,而Adgfp感染組分別為(8.14±2.16)%,(7.82±2.32)%,(6.16±2.86)%，二者比較，差異有統計學意義（P<0.01）.

2.4Adpten對HO8910PM細胞形態的影響重組腺病毒Adpten感染及非病毒感染(對照)的3組HO8910PM細胞,經HE染色光鏡下觀察可見，正常對照及Adgfp處理組細胞成片生長，細胞間隙緊密，胞質舒展，核分裂現象明顯.Adpten處理組細胞則細胞間隙變大，胞質紅，核固縮，易見凋亡小體(圖3).

A:PBS對照組;B:Adgfp處理組;C:Adpten處理組.

圖3Adpten感染對HO8910PM細胞形態的影響HE×400

2.5Adpten對HO8910PM細胞遷移能力的影響重組腺病毒Adpten感染后的指數生長期高轉移卵巢癌HO8910PM細胞與對照組(PBS空白組和Adgfp組)比較，Adpten能有效地抑制HO8910PM細胞的遷移（圖4）.

2.6Adpten誘導HO8910PM細胞凋亡Hoechst33258熒光染色結果顯示,重組腺病毒Adpten感染HO8910PM細胞48h后，Adpten感染組出現典型的凋亡形態學改變，可見胞體縮小、胞漿濃縮、核染色質聚集、核固縮，還可見膜包裹的凋亡小體.而PBS對照組和Adgfp組的細胞均未發生形態學的改變（圖5）.

3討論

隨著分子生物學及分子遺傳學的發展，癌基因的激活和抑癌基因的突變失活，是目前較為公認的腫瘤發生發展的重要原因之一.本文研究的抑癌基因pten，其突變和缺失常見于多種惡性腫瘤，與腫瘤的發生發展有著密切關系.目前普遍使用的腫瘤的基因治療方法是導入外源性野生型抑癌基因補充或替代突變的抑癌基因.我們選用重組腺病毒載體導入抑A0,A1:PBS對照組;B0,B1:Adgfp處理組;C0,C1:Adpten處理組;A0,B0,C0:0h;A1,B1,C1:感染后48h.

癌基因pten，其極少發生插入突變，載體操作方便、宿主廣泛、容易繁殖，并具有攜帶外源基因容量大，可表達接近翻譯后成熟水平蛋白質等特點，已廣泛用于多種疾病的體內基因治療.國外報道的AdEasy系統［9］除具有腺病毒載體的一般優點外，還具備以下優點：①在細菌體內完成同源重組，重組效率高，周期短；②利用含不同抗生素篩選重組子，簡化了篩選工作；③經重組的腺病毒帶有gfp基因，可直接通過熒光顯微鏡監測病毒的生成，病毒滴度的測定和對宿主細胞的轉導效率的檢測都較傳統方法簡便易行.我們利用AdEasy腺病毒載體系統構建了攜帶野生型pten基因的重組腺病毒，導入人高轉移卵巢癌H

O8910PM細胞，證實pten基因在HO8910PM細胞中能高效地表達.通過MTT比色檢測，發現Adpten對HO8910PM細胞具有顯著的增殖抑制作用，能有效地抑制該癌細胞生長.細胞劃痕實驗證明Adpten能有效地抑制該癌細胞的遷移.Hoechst33258凋亡染色結果也表明pten具有誘導該癌細胞凋亡的作用.

本研究結果表明，攜帶野生型pten基因的重組腺病毒是一種高效的基因轉移系統，能將pten目的基因轉移到受體細胞中，對人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞產生強有力的生長抑制及凋亡誘導效應，并能抑制該癌細胞遷移，為進一步的基因治療卵巢癌的研究奠定了基礎.

【參考文獻】

［1］馬佳佳,陳必良,馬向東,等.抑癌基因PTEN在子宮內膜癌組織中的表達［J］.第四軍醫大學學報,2004,11:1015-1018.

［2］HaimanCA,StramDO,ChengI,mongeneticvariationatPTENandriskofsporadicbreastandprostateCancer［J］.CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2006,15:1021-1025.

［3］TsurutaH,KishimotoH,SasakiT,etal.HyperplasiaandcarcinomasinPtendeficientmiceandreducedPTENproteininhumanbladdercancerpatients［J］.CancerRes,2006,66:8389-8396.

［4］FurnariFB,HuangHJ,CaveneeWK.ThephosphoinositolphosphataseactivityofPTENmediatesaserumsensitiveG1growtharrestingliomacells［J］.CancerRes,1998,58(22):5002-5008.

［5］ZhuXY,KwonCH,SchlosshauerPW,etal.PTENInducesG1cellcyclearrestanddecreasescyclinD3levelsinendometrialcarcinomacells［J］.CancerRes,2001,61:4569-4575.

［6］SaitoY,SwansonX,MhashilkarAM,etal.AdenovirusmediatedtransferofthePTENgeneinhibitshumancolorectalcancergrowthinvitroandinvivo［J］.GeneTher,2003,10(23):1961-1969.

［7］MajhenD,AmbriovicRistovA.Adenoviralvectors-Howtousethemincancergenetherapy［J］?VirusRes,2006,119(2):121-133.

［8］熊亮,謝富華,趙樹勇,等.以AdEasy載體系統快速構建PTEN重組腺病毒表達載體［J］.廣東醫學,2007,28(4):516-518.

［9］HeTC,ZhouS,CostadaLT,etal.Asimplifiedsystemforgeneratingrecombinantadenoviruses［J］.ProcNatlAcadSciUSA,1998,9(5):2509-2514.新晨