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作者：李紅梅,宋天保于月成,辛?xí)匝?張明,許靜洪

【摘要】目的：利用基因工程技術(shù)克隆TRAIL基因全長(zhǎng)cDNA，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體.方法：從人胎盤中提取總RNA，利用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增了trail，將其連接于克隆載體pMD18T中，并通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定載體構(gòu)建的正確性.結(jié)果：應(yīng)用RTPCR技術(shù)和BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切成功獲得1049bp的目的片段，測(cè)序分析結(jié)果表明該基因序列與報(bào)道的TRAIL基因片段的序列完全相同.結(jié)論：成功克隆了TRAIL基因的cdna全長(zhǎng)，為其在腫瘤生物治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

【關(guān)鍵詞】腫瘤壞死因子;細(xì)胞凋亡;配體；RTPCR；序列測(cè)定；人胎盤

0引言

1995年Wiley和Pitt首次從人的表達(dá)標(biāo)簽文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)與腫瘤壞死因子家族基因序列具有高度同源性的DNA克隆，其表達(dá)的蛋白具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，因而將其命名為腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體（tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL）［1-2］.作為一種新的凋亡誘導(dǎo)配體，腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體(TRAIL)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，就一直倍受關(guān)注.有關(guān)TRAIL和TRAIL受體以及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究己取得很大進(jìn)展，而TRAIL特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)制目前尚未闡明.作為一種特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡且無(wú)明顯毒副作用的分子，TRAIL極有可能成為新的抗腫瘤制劑［3-4］.研究表明，TRAIL在選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)對(duì)正常組織沒有明顯細(xì)胞毒性，并且和放、化療有協(xié)同作用，使得TRAIL在腫瘤的治療上具有廣闊的前景［5-6］.我們采用RTPCR方法克隆了TRAIL全長(zhǎng)的基因片段，經(jīng)酶切和測(cè)序證實(shí)其正確性，為進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料大腸桿菌DH5α由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18T載體、EcoRI,BamHI內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000購(gòu)自大連TaKaRa公司，胰蛋白胨（Tryptone），酵母提取物（Yeastextract）購(gòu)自英國(guó)OXOIDLTD公司，質(zhì)粒抽提試劑盒及凝膠回收試劑盒購(gòu)自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，PCR引物由上海博亞生物工程有限公司合成.

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank報(bào)道的TRAIL基因的序列并參照已發(fā)表的文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成兩條引物.上游引物P1序列為:5′GAATTCcggctgcctggctgacttac3′，劃線處為EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)；下游引物P2序列為:5′GGATCCtttttggttgtggctgctctac3′，劃線處為BamHⅠ的酶切位點(diǎn).

1.2.2胎盤組織中總RNA提取采用Trizol一步法提取人胎盤組織中總RNA.稱取100mg新鮮人胎盤組織，加入1mLTrizol勻漿，裂解5min.加入氯仿進(jìn)行液相分離.取上層水相，轉(zhuǎn)至另一離心管中.加異丙醇沉淀，離心10min后棄上清，RNA沉淀于管底.加700mL/L乙醇洗滌，溫和震蕩離心管，懸浮沉淀.再次離心5min；盡量棄上清；37℃干燥后，溶于DEPC水中.取其中2μL溶液紫外分光光度計(jì)定量，其余貯存于-80℃待用.

1.2.3RTPCR取5μL總RNA，按Fermentas試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作.擴(kuò)增參數(shù)為：70℃水浴5min，37℃水浴5min，42℃水浴60min，70℃水浴15min，冰浴，待用.然后以cDNA為模板，PCR反應(yīng)條件為：95℃變性3min后，按94℃30s，55℃30s，72℃1min的順序循環(huán)30次，再于72℃延伸7min.取PCR產(chǎn)物5μL在含溴化乙啶的10g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳.

1.2.4PCR產(chǎn)物的純化、克隆與鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)束后，在紫外檢測(cè)儀下切取所需大小的凝膠片段，按凝膠回收試劑盒操作說(shuō)明第一次回收目的片斷.將回收產(chǎn)物用EcoRI和BamHⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切第二次回收目的凝膠片段，酶切產(chǎn)物在含溴化乙啶的10g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，緩沖液為0.5×TBE，電泳結(jié)束后，在紫外檢測(cè)儀下切取目標(biāo)片段，第三次回收.取凝膠回收純化的PCR產(chǎn)物4μL加入pMD18T載體1μL,LigationSolutionⅠ5μL,16℃連接過(guò)夜.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,然后將連接產(chǎn)物涂布于含100μg/mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基平板中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜.挑取單菌落加入5mL含100μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基試管中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜.采用質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提,對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和BamHI雙酶切鑒定,鑒定陽(yáng)性的載體送大連TAKARA公司測(cè)序.將測(cè)序證實(shí)完全正確的序列命名為pMD18TTRAIL,保存菌種.

2結(jié)果

2.1TRAIL基因的克隆提取胎盤組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此為模板進(jìn)行PCR,PCR產(chǎn)物的大小約為1049bp(圖1)，無(wú)雜帶、特異性良好,與我們所設(shè)計(jì)的相吻合，克隆后片段大小與PCR產(chǎn)物大小吻合.

2.2TRAIL基因重組載體的酶切鑒定用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切含有TRAIL基因的pMD18T載體，獲得大小為1049bp的目的片段(圖2)，表明含有TRAIL基因的克隆載體構(gòu)建成功.

2.3TRAIL基因的序列分析以定向克隆入pMD18T載體中的TRAIL基因的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,挑取均含有目的基因片段的5個(gè)菌落，取其中1個(gè)菌落做序列測(cè)定證實(shí)，所得序列的結(jié)果聯(lián)網(wǎng)到

NCBI進(jìn)行同源性分析.核酸序列與質(zhì)粒pMD18TTRAIL中的TRAIL序列同源性為99.69%，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)堿基突變.在NCBI的ORFfinder中，服務(wù)器分析開放閱讀框架，翻譯成281個(gè)氨基酸序列，進(jìn)行同源性分析，同源性為100%.說(shuō)明測(cè)序結(jié)果中的兩個(gè)堿基突變?yōu)橥x突變，外源TRAIL基因可以正確表達(dá).

3討論

TRAIL為腫瘤壞死因子(TNF)超家族的新成員.人的TRAIL基因編碼一種Mr32500的II型跨膜蛋白，該蛋白由281個(gè)氨基酸殘基組成.其氨基端位于胞外區(qū)，可形成同源二聚體與相應(yīng)的膜受體結(jié)合，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞凋亡.研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡主要通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮作用.隨著研究的深入,后來(lái)相繼發(fā)現(xiàn)了與TRAIL結(jié)合的受體共有5種，它們的功能也漸趨清楚［7-8］.其5種受體為：兩種死亡受體即DR4(deathreceptor4)和DR5(deathreceptor5)；兩種誘騙受體即DcR1(decoyreceptorl)和DcR2(decoyreceptor2)；一種可溶性受體骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)，是調(diào)節(jié)骨密度有關(guān)的受體(regu1atingbonedensityreceptor).DR4和DR5具有TNF受體超家族其它成員類似的胞漿死亡結(jié)構(gòu)域(plasmicdeathdomain)，其與TRAIL特異結(jié)合后可通過(guò)死亡結(jié)構(gòu)域激發(fā)和傳導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)，激活caspase蛋白酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［9-10］.

腫瘤治療一直是治療性細(xì)胞凋亡干預(yù)的重要應(yīng)用領(lǐng)域.TNF和FasL或Fas單克隆抗體很早就被用于腫瘤的治療.它們?cè)隗w外都能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞迅速凋亡，有效殺傷腫瘤細(xì)胞，但皆因嚴(yán)重的毒副作用，其中主要是對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的殺傷作用，限制了它們的臨床應(yīng)用.TRAIL能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，但其mRNA在組織中的廣泛分布提示它對(duì)正常組織細(xì)胞可能沒有毒性.研究提示，正常組織細(xì)胞因具有TRAIL誘騙受體(decoyrecptor)，能逃避TRAIL的攻擊，而腫瘤細(xì)胞不具有這一保護(hù)性受體，不能抵御TRAIL的殺傷作用［11］.由于TRAIL誘導(dǎo)凋亡機(jī)制不同于TNF，因此對(duì)其抗腫瘤作用價(jià)值的評(píng)價(jià)就顯得十分重要.

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