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1儀器與試藥

1．1儀器

日立L??7200高效液相色譜儀（日本）；日立L??7485型熒光檢測器（日本）；81??2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）。

1．2試藥

雌二醇（浙江醫藥股份有限公司仙居制藥廠）；烏拉坦（中國醫藥上海化學試劑公司）；隨機甲基化?撥陋不泛?精（randomlymethylatedβ??cyclodextrin,RAMEB,德國瓦克公司）；殼聚糖（大連鑫蝶甲殼素有限公司）；對羥基苯甲酸乙酯（沈陽市東興試劑廠）；苯扎氯銨（Sigma公司）；甲醇（色譜純，天津康科德試劑公司）；其他試劑均為分析純。

1．3動物

Wistar雄性大鼠(體質量220～250g)，廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2003??002。

2方法

2．1樣品的配制

2．1．1E2鼻腔噴霧劑的制備E2與RAMEB以1∶1的摩爾比制備包合物，殼聚糖的用量為1％，苯扎氯銨的用量為0.01％，氯化鈉調節等滲，pH值在4.0～6.0之間。

2．1．2E2??RAMEB包合物溶液的制備稱取適量的E2??RAMEB包合物溶解于生理鹽水中，氯化鈉調節等滲，即得。

2．1．3E270％乙醇溶液的制備稱取E2原料藥適量，將其溶于70％乙醇中即得。

2．1．4E2注射劑的制備稱取適量的E2，將其溶解于注射用水配制的0.01％（質量濃度）RAMEB溶液中，即得。

2．2給藥劑量的確定

按體表散熱量折算，250g大鼠的劑量為60kg人用劑量的0.025倍，再根據鼻腔給藥和靜脈注射給藥的差異性及在測定過程中的準確性，確定雌二醇鼻腔噴霧劑的給藥劑量分別為0.16、0.48和1.60mg?kg-1，E2??RAMEB包合物生理鹽水溶液、雌二醇乙醇溶液劑和靜脈注射給藥的劑量均為0.16mg?kg-1。

2．3給藥方法及血漿樣品的采集

2．3．1鼻腔給藥方法及血漿樣品的采集取雄性SD大鼠，體質量200～250g，腹腔注射1.2g?kg-1的烏拉坦使大鼠麻醉，固定，打開頸部，暴露氣管與食管，取一段聚乙烯管插入氣管以維持呼吸。再在頸總靜脈上插管供取血用。用微量注射器前接一柔軟PE管插入大鼠鼻孔約5mm，緩慢滴入藥液。給藥后立即結扎食管以防藥液從鼻腔流失。給藥后取血時間點為5、10、20、30、45、60、90、120、150、180min，每次取血0.4mL，8000r?min-1離心15min，取出上層血漿，－20℃冷凍保存。

2．3．2靜脈給藥方法及血漿樣品的采集大鼠麻醉，剪開一側腹股溝皮膚，暴露淺表股靜脈，分離覆蓋黏膜層，左手食指按住股靜脈近心端，待股靜脈充盈后，1mL注射器配4號針頭，以30°角進行靜脈穿刺，推注藥液無阻力感，表明針頭在血管中，繼續緩慢推完藥液，給藥完畢后用干棉球壓迫止血。眼眶取血。給藥后取血時間點為5、10、20、30、45、60、90min，每次取血0.4mL，8000r?min-1離心15min，取出上層血漿，－20℃冷凍保存。

2．4RP??HPLC熒光法測定血漿中E2的濃度［5，6］

2．4．1色譜條件色譜柱為KromasilODSC18色譜柱（250mm×4.6mm,5μm,Zirchrom）；流動相為乙腈?菜?（體積比40∶60），流速為1mL?min-1；熒光的激發波長為267nm，發射波長為302nm；檢測溫度為30℃。

2．4．2內標溶液的配制精密稱取對羥基苯甲酸乙酯50mg，置50μL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得內標儲備液。用甲醇稀釋為12.5μg?mL-1的內標溶液。

2．5血漿樣品處理和測定方法

取全血約0.5mL，于8000r?min-1離心10min，精密量取血漿0.2μL，置刻度具塞試管中，用微量進樣器加內標溶液5μL，旋渦振蕩2min，再加入5mL乙醚，旋渦振蕩5min，于3000r?min-1離心5min，吸取上層乙醚，40℃用氮氣吹干，然后加入200μL甲醇溶解，每次進樣50μL。以E2和內標峰面積比R＝As／Ai（As為E2峰面積，Ai為內標峰面積）為定量依據，計算樣品中E2的含量。

2．6樣品穩定性試驗

取大鼠空白血漿200μL，配制E2低、中、高3個濃度（濃度分別1.984、99.200和496.000ng?mL-1）的血漿樣品，樣品經液?慘禾崛〈?理后，室溫（約20℃）下放置24h測定，以考察處理后的E2血漿樣品在室溫下的穩定性。每一濃度進行3樣本分析。3個濃度下血漿樣品中E2測定均值與加入值之間的相對誤差（RE/%）分別為3.1%，2.1%和5.3%，表明血漿樣品處理后在室溫下至少可穩定存放24h。

同法配制低、中、高3個濃度（濃度分別1.984、99.200和496.000ng?mL-1）的血漿樣品，經反復3次-20℃冷凍，室溫溶解后，測定樣品濃度，以考察樣品在冷凍和凍融條件下的穩定性。每一濃度進行3樣本分析。3個濃度下血漿樣品中E2測定均值與加入值之間的相對誤差（RE/%）分別-1.9%，-3.3%和1.6%，表明血漿樣品在冷凍?踩諶苧?環3次試驗中無明顯降解。

2．7大鼠體內藥物濃度?彩奔淝?線

大鼠鼻腔及靜脈注射給予E2后的平均血藥濃度對時間做圖得藥物濃度?彩奔淝?線；利用統計矩法對血漿藥物濃度數據進行分析（Cmax和Tmax采用實測值）。

2．8絕對生物利用度

將各鼻腔給藥組的血藥濃度?彩奔淝?線下面積與靜脈注射給藥組的曲線下面積相比較，按下列公式得各鼻腔給藥組E2的絕對生物利用度（F）。

F=AUC0→∞(i.n)/Xi.n.AUC0→∞(i.v.)/Xi.v.×100%

3結果

3．1大鼠體內藥物濃度?彩奔淝?線

各樣品大鼠鼻腔及靜脈注射給予E2后的平均血藥濃度?彩奔淝?線見圖1-4。

3．2絕對生物利用度

計算各鼻腔給藥組E2絕對生物利用度，結果見表1。

圖1雌二醇鼻腔噴霧劑鼻腔給藥后大鼠體內血藥濃度?彩奔涔叵登?線圖（略）

Figure1Plasmaconcentration??timecurvesinratsnasallyadministeredwithestradiolnasalsprayatthedosesof0.16,0.48,and1.60mg?kg-1

圖2雌二醇環糊精包合物溶液鼻腔給藥后大鼠體內血藥濃度?彩奔涔叵登?線圖（給藥劑量：0.16mg?kg-1）（略）

Figure2Plasmaconcentration??timecurvesinratsnasallyadministeredwithestradiol??RAMEBsolutionatthedoseof0.16mg?kg-1

圖3雌二醇乙醇溶液鼻腔給藥后大鼠體內血藥濃度?彩奔涔叵登?線圖（給藥劑量：0.16mg?kg-1）（略）

Figure3Plasmaconcentration??timecurvesinratsnasallyadministeredwithestradiol??ethanolsolutionatthedoseof0.16mg?kg-1

圖4靜脈注射雌二醇溶液后大鼠體內血藥濃度?彩奔涔叵登?線圖（給藥劑量：0.16mg?kg-1）（略）

Figure4Plasmaconcentration??timecurvesinratsintra??venouslyinjectedwithestradiol??ethanolsolutionatthedoseof0.16mg?kg-1

表1鼻腔給藥后各制劑的主要藥動學參數（略）

br1Pharmacokineticparametersafternasaladministeredwithdifferentpreparationsofestradiol

由于E2鼻腔噴霧劑的體內過程復雜，藥時曲線無法按現有的數學模型進行處理，因此，采用梯形法計算AUC，并經統計矩處理計算MRT等藥動學參數。檢驗結果顯示，E2鼻腔噴霧劑0.16mg?kg-1劑量組的Cmax與E2鼻腔噴霧劑1.60mg?kg-1劑量組和E2??RAMEB包合物溶液組之間差異有顯著性，AUC與E2鼻腔噴霧劑0.48、1.60mg?kg-1劑量組和E2乙醇溶液劑組間差異有顯著性（P<0.05）。經計算3個劑量組的E2鼻腔噴霧劑的絕對生物利用度分別為86.87％、65.83％和48.99％，E2??RAMEB包合物溶液組和E2乙醇溶液劑組的絕對生物利用度分別為56.44％和24.38％。E2鼻腔噴霧劑0.16和0.48mg?kg-1劑量組的絕對生物利用度均高于單獨鼻腔給予E2??RAMEB包合物溶液，從而說明鼻腔給予E2鼻腔噴霧劑提高了E2鼻腔吸收的生物利用度。

4討論

4．1動物模型的選擇

選擇合適的動物模型對于確定鼻腔給藥后藥物的有效性非常重要。大鼠等哺乳動物的嗅細胞散在分布于整個鼻腔中，與人體嗅黏膜分布于鼻腔頂部不同，并且嗅細胞數量多，嗅黏膜占鼻黏膜總表面積的比例也高于人體，所以大鼠鼻腔給藥后的實驗結果只能作為人體的一種參考。雖然不能直接將大鼠的研究數據推之于人，但可認為其轉運趨勢是一致的。

4．2研究方法的建立

大鼠鼻腔給藥的研究方法是Harai等于1981年建立的［7］。為了將藥物完全保留在鼻腔中，Harai等采用膠黏劑聚α?睬杌?丙烯酸酯封堵鼻腭通道，減少藥物向口腔的清除。由于膠黏劑封堵鼻腭通道時易滲入大鼠鼻腔，瞬間黏合形成膠狀膜，影響藥物的鼻黏膜吸收，且對動物的損傷大，故本研究采用給藥后立即結扎食管來代替膠黏劑封堵，操作簡便且可有效防止藥液吞咽。新晨

4．3吸收結果的討論

雌二醇的乙醇溶液鼻腔給藥并沒有觀察到吸收相，其可能的原因是乙醇作為一種滲透促進劑能夠顯著的提高藥物對于鼻腔黏膜的通透性，增加藥物對于黏膜的透過速率；其次，鼻腔纖毛的擺動運動也會將一部分的藥物清除；即在測定時間點前，藥物已經達到了吸收的峰值，因此在第一個時間點開始并未觀察到藥物的吸收相。

【參考文獻】

［1］GENAZZANIAR,GAMBACCIANIM.HRTinthethirdmillennium［J］.Maturitas,2001,38(1):49-55.

［2］O′CONNELLMB.Pharmacokineticandpharmacologicvariationbetweendifferentestrogenproducts［J］.JClinPharmacol,1995,35:18-24.

［3］FRASERDI，PARSONA,WHITEHEADMI,etal.Theoptimaldoseoforalnorethindroneacetateforadditiontotransdermalestradiol：amulticenterstudy［J］.FertilSteril,1990,53:460-468.

［4］鄭彩虹，梁文權.陰道內給藥系統發展現狀［J］.中國現代應用化學雜志，2002,19(6):465-469.

［5］YOONY,WESTERHOFFP,SNYDERSA,etal.HPLC??fluorescencedetectionandadsorptionofbisphenolA,17β??estradiol,and17α??ethynylestradiolonpowderedactivatedcarbon［J］.WaterRes,2003,37(14):3530-3537.

［6］ALKHARFYKM,FRYERF.Sensitiveliquidchromato??graphicmethodusingfluorescencedetectionforthedeterminationofestradiol3??and17??glucuronidesinratandhumanlivermicrosomalincubations:formationkinetics［J］.JChromB,2002,774:33-38.

［7］HIRAIS,YASHIKIT,MIMAH.Effectofsurfactantsonthenasalabsorptionofinsulininrats［J］.IntJPharm,1981,9:165-172.