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瓜馥木化學成分范文

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1儀器與材料

顯微熔點測定儀(溫度計未校正);AB-HS型質譜儀;DRX-400型超導核磁共振儀,TMS為內標。3164型二氧化碳培養箱(美國FORMA公司);比色采用ThermoLabsystemsMultiskanMK3全自動酶標儀。

藥材采于江西,由江西中醫學院賴學文副教授鑒定為瓜馥木Fissistigmaoldhamii(Hemsl.)Merr.,標本存于廣東醫學院藥學教研室。

2方法與結果

2.1提取與分離瓜馥木根藥材經粉碎后用乙醇加熱回流提取(3h×3次),合并濾液,減壓濃縮得總浸膏590g。浸膏用5%HCl捏溶處理后其酸不溶性部分用蒸餾水洗至中性,用水分散均勻,依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯進行提取,回收溶劑得石油醚部分33.2g,氯仿部分63g,醋酸乙酯部分45.4g。氯仿部分反復進行硅膠柱色譜,以三氯甲烷-甲醇為洗脫劑,得馬兜鈴內酰胺AⅡ化合物(15mg)。

2.2結構鑒定采用化學和光譜的方法進行結構鑒定。該化合物與生物堿試劑反應呈陽性,推測該化合物為生物堿。EI-MS給出分子離子m/z265(M+,100),結合1H-NMR、13C-NMR,推斷分子式為C16H11NO3。UVλMeOHmaxnm:230,265,277;IRKBrmaxcm-1:3450,3251(羥基,NH),1691,1656(羰基),1614,1502(苯環);EI-MS譜:265(M+,100),250(M+-CH3,51),222(M+-CH3-CO,18),UV,IR,EI-MS的特征顯示該化合物屬于馬兜鈴內酰胺類成分[3]。1H-NMR顯示在δ4.04(3H,s)為一甲氧基信號;δ7.08~9.26ppm處有6個芳香質子信號,其中δ9.26(1H,m),7.49(2H,m),7.77(1H,m)顯示出未取代的D環有4氫,H-5由于受3個環的去屏蔽作用,出現在最低場的δ9.26ppm處,可知δ7.49(2H,m)為H-6,H-7,δ7.77(1H,m)為H-8;δ7.08(1H,s)及7.68(1H,s)二個孤立芳香質子信號顯示A、C環上各有一孤立芳香質子,因此,A環中有兩個芳香質子被取代。13C-NMR顯示在δ171.8ppm處為內酰胺羰基信號,在δ150.7~107.1有14個芳碳信號,DEPT顯示有9個季碳、6個叔碳信號,δ57.4處為甲氧基。該化合物的UV,IR,1H-NMR,13C-NMR,EI-MS數據與文獻[3,4]中的馬兜鈴內酰胺AⅡ(AristolactamAⅡ)數據基本一致。因此,該化合物被鑒定為AristolactamAII,結構式見圖1。

圖1瓜馥木中各化合物結構式(略)

2.3樣品體外培養抗腫瘤作用實驗

2.3.1實驗分組實驗分為①空白組:每孔僅為1640培養液,在測光密度值(OD值)時用于調“0”;②對照組:每孔為含1640培養液稀釋的單細胞懸液;③實驗組:又分1.00×103,1.00×102,10.00,1.00,0.10,1.00×10-2μmol·L-1馬兜鈴內酰胺AⅡ組,即每孔含1640培養液稀釋的單細胞懸液和不同濃度馬兜鈴內酰胺AⅡ。精密稱量馬兜鈴內酰胺AⅡ后用少量DMSO充分溶解,再用1640培養基稀釋成不同濃度備用。各組每孔溶液總體積均為200.00μl。

2.3.2MTT法檢測藥物的抗腫瘤實驗取已貼壁的GLC-82細胞,用質量濃度為0.25%胰酶消化后,計數活細胞,用1640培養基稀釋成5×104/ml的單細胞懸液備用;取對數生長期的懸浮HL60細胞用1640培養基稀釋成1×105/ml的單細胞懸液備用。分別將兩種單細胞接種到96孔培養板,每組設4個復孔,對照組每孔加單細胞懸液200.00μl,不同濃度實驗組每孔加單細胞懸液190.00μl和不同濃度的馬兜鈴內酰胺AⅡ10.00μl;對照組和不同濃度實驗組細胞接種后置于37℃,100%相對濕度,含5%CO2和95%空氣的培養箱中預培養48h;然后取出,仔細地吸去上清液,于每孔中加入150.00μlDMSO,輕輕振蕩以使甲臜完全溶解;約1h后于490nm波長處用酶標儀測OD值。按抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%計算。采用SPSS11.5統計軟件包進行統計分析,各組間樣本均數采用Dunnett-t檢驗。實驗數據及分析結果見表1。并用Probit回歸法[5]估算半數抑制濃度(IC50值),馬兜鈴內酰胺AⅡ對GLC-82,HL60細胞的IC50分別為234.35,101.17μmol·L-1。

表1馬兜鈴內酰胺AⅡ對GLC-82及HL60細胞抑制的影響(略)

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;n=4

3討論

本研究用MTT法研究發現:從瓜馥木中分離得到的單體化合物馬兜鈴內酰胺AⅡ堿對GLC-82細胞和HL60細胞均表現出一定的腫瘤抑制作用,且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強,作用強度與劑量呈一定的量效關系。

在低劑量1μmol·L-1以下時,馬兜鈴內酰胺AⅡ對肺腺癌GLC-82細胞株的作用不明顯(P>0.05),但對于白血病HL60細胞株抑制作用在劑量0.10μmol·L-1以上時作用明顯(P<0.01)。通過回歸計算的IC50分別為234.35,101.17μmol·L-1,其作用效果不同,表明馬兜鈴內酰胺AⅡ對兩種細胞株有一定的選擇作用,作用機制尚須進一步研究。

從瓜馥木中分離得到的O-甲基芒籽堿、氧代克斑寧等化合物對肺腺癌GLC-82細胞株亦有抗癌活性且作用強度相似(IC50分別為83.31,109.17μmol·L-1)[5],但馬兜鈴內酰胺AⅡ的IC50為234.35μmol·L-1,其作用強度不同,可能與化合物的結構類型有關(見圖1)。化合物O-甲基芒籽堿、氧代克斑寧為阿樸菲類型生物堿,馬兜鈴內酰胺AⅡ為馬兜鈴內酰胺類型生物堿,研究表明針對肺腺癌GLC-82細胞株,化合物的結構母核起主導作用,各取代基團對它的生物活性有一定的影響。初步構效關系研究表明,阿樸菲類型的生物堿對肺腺癌GLC-82細胞株的毒性作用稍強。

瓜馥木中生物堿為瓜馥木抗炎、鎮痛作用主要有效成分[6],MTT實驗法表明瓜馥木中的生物堿亦具抗腫瘤活性作用,提示瓜馥木藥材值得深入研究。

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