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1材料與儀器
細(xì)胞株：人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所,由廣西腫瘤防治研究所臨床中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存。細(xì)胞用含有10%滅活小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。MR-300酶標(biāo)儀為美國(guó)產(chǎn),倒置顯微鏡為日本產(chǎn)。MTT(噻唑藍(lán))購(gòu)自Sigma公司,RPMI1640和小牛血清為Gibco公司產(chǎn)品，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?a href="http://www.gaoruijun.cn/fllw/zyyxlw/541005.html" target="_blank">莪術(shù)油注射液購(gòu)自黑龍江瑞格制藥有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：051101,國(guó)藥準(zhǔn)字：H20023314）。
2方法
2.1噻唑藍(lán)(MTT)法確定莪術(shù)油注射液對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的存活抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌SKOV3細(xì)胞,濃度為5×103個(gè)/ml，加入到96孔板，每孔加含細(xì)胞的培養(yǎng)液180μl,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h后,以依次加入終濃度為15.625，31.25，62.5，125，250μg/ml莪術(shù)油注射液,同時(shí)以1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組,每孔的終體積均為200μl，分別培養(yǎng)12，24，36，48h后加入20μlMTT(2g·L-1),37℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育4h后,棄上清液,每孔加入DMSO200μl,于492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度OD值，每個(gè)濃度平行測(cè)定3孔。按下列公式求出生長(zhǎng)抑制率(IR)，通過(guò)由IR對(duì)濃度作圖,求出半數(shù)抑制濃度IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。
生長(zhǎng)抑制率IR（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/空白對(duì)照平均A值）×100%
2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡觀察：細(xì)胞爬片后,分別加入31.25，62.5，125μg/ml濃度的莪術(shù)油注射液作用48h后，倒置顯微鏡觀察，攝片。
2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析分析，計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，當(dāng)P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。
3結(jié)果
3.1MTT法檢測(cè)結(jié)果MTT法檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)間莪術(shù)油注射液對(duì)SKOV3細(xì)胞抑制效果，見(jiàn)表1。
結(jié)果表明，莪術(shù)油注射液對(duì)SKOV3細(xì)胞體外生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，其抑制作用隨時(shí)間、濃度的增加而不斷加強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的-時(shí)-效、量-效關(guān)系，其中各濃度藥物作用48h后的抑制效果最好,計(jì)算出IC50=55.16μg/ml。a=-0.3390，b=0.2356，r=0.9271。
3.2倒置顯微鏡結(jié)果（細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化）細(xì)胞培養(yǎng)48h后觀察，空白對(duì)照組SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，分裂相較多，細(xì)胞透明，細(xì)胞間連接緊密，密度較大呈復(fù)層性生長(zhǎng)，部分重疊成簇狀，形態(tài)多樣，多角形或短梭形,胞核圓形或橢圓形,多突起，具有較好的折光性，胞漿豐富透亮,部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)分泌顆粒，細(xì)胞為梭形或短梭形，細(xì)胞內(nèi)顆粒較少，細(xì)胞核隱約可見(jiàn)，培養(yǎng)液中極少見(jiàn)懸浮的死亡細(xì)胞以及細(xì)胞碎片（見(jiàn)圖1～2）。選擇31.25，62.5，125μg/ml濃度的莪術(shù)油作用細(xì)胞48h后觀察,大體可見(jiàn)細(xì)胞密度明顯減少，胞體變長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)顆粒感增強(qiáng)，細(xì)胞界限模糊,細(xì)胞間隙逐漸增寬，細(xì)胞質(zhì)減少,胞漿減少,細(xì)胞脫落呈懸浮狀,存活細(xì)胞減少，細(xì)胞核碎裂，可見(jiàn)細(xì)胞碎片，隨著莪術(shù)油作用濃度的增加，上述現(xiàn)象更加明顯（具體見(jiàn)圖3～8）。
表1莪術(shù)油注射液對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制率（略）
不同濃度之間比較的方差分析結(jié)果為F=309.901，組間均為P＜0.01；不同時(shí)間各組之間的方差分析結(jié)果為F=103.571，組間均為P＜0.01
圖1人卵巢癌SKOV3細(xì)胞(100×,細(xì)胞鑲嵌排列,呈柵欄狀或成腺趨勢(shì)生長(zhǎng))（略）
圖2人卵巢癌SKOV3細(xì)胞(200×，顯示瘤細(xì)胞形態(tài))（略）
圖3濃度31.25μg/ml莪術(shù)油作用后卵巢癌SKOV3細(xì)胞顯微鏡觀察圖(100×，部分細(xì)胞核開(kāi)始變形，顆粒感增強(qiáng))（略）
圖4濃度31.25μg/ml莪術(shù)油作用后卵巢癌SKOV3細(xì)胞顯微鏡觀察圖(200×，部分細(xì)胞體積增大，胞漿減少，培養(yǎng)液中出現(xiàn)死亡細(xì)胞)（略）
圖5濃度62.5μg/ml莪術(shù)油作用后卵巢癌SKOV3細(xì)胞顯微鏡觀察圖(100×，細(xì)胞損傷明顯加重，細(xì)胞核變形明顯)（略）
圖6濃度62.5μg/ml莪術(shù)油作用后卵巢癌SKOV3細(xì)胞顯微鏡觀察圖(200×，多數(shù)細(xì)胞體積增大，胞漿明顯減少，培養(yǎng)液中死亡細(xì)胞增多)（略）
圖7濃度125μg/ml莪術(shù)油作用后卵巢癌SKOV3細(xì)胞顯微鏡觀察圖(100×，核漿比例增大,細(xì)胞排列極性消失，顆粒感明顯)（略）
圖8濃度125μg/ml莪術(shù)油作用后卵巢癌SKOV3細(xì)胞顯微鏡觀察圖(200×，細(xì)胞損傷非常明顯，細(xì)胞質(zhì)顆粒脫落，胞漿溶解，培養(yǎng)液中大量死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片)（略）
4討論
莪術(shù)油作為一種具有良好應(yīng)用前景的抗癌藥物,其方便、快捷、經(jīng)濟(jì)，日益引起人們的重視,成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以莪術(shù)油注射液5種濃度,分別作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞12，24，36，48h后,發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng),抑制率也增加。實(shí)驗(yàn)表明，藥物作用48h效果最明顯,利用中效方程式計(jì)算出48h的IC50值為55.16μg/ml；小劑量莪術(shù)油(15.625μg/ml)對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制作用并不明顯。用濃度為31.25，62.5，125，250μg/ml莪術(shù)油作用SKOV3細(xì)胞48h后，其抑制率有明顯的量-效關(guān)系；250μg/ml的莪術(shù)油抑制率高達(dá)86.7%，但是在倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)滿視野的細(xì)胞碎片，絕大多數(shù)細(xì)胞壞死，幾乎找不到貼壁細(xì)胞。因此，選擇濃度為31.25，62.5，125μg/ml的莪術(shù)油作用SKOV3細(xì)胞48h后，主要從細(xì)胞體積、細(xì)胞質(zhì)感、細(xì)胞漿、細(xì)胞質(zhì)等方面，通過(guò)倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察：與對(duì)照組比較，31.25μg/ml濃度莪術(shù)油作用后可見(jiàn)部分細(xì)胞核開(kāi)始變形，顆粒感增強(qiáng)，細(xì)胞體積增大，胞漿減少；62.5μg/ml濃度莪術(shù)油作用后可見(jiàn)細(xì)胞損傷明顯加重，細(xì)胞核變形明顯，多數(shù)細(xì)胞體積增大，胞漿明顯減少，細(xì)胞界限模糊；125μg/ml濃度莪術(shù)油作用后可見(jiàn)核漿比例增大,細(xì)胞排列極性消失，顆粒感明顯，細(xì)胞損傷非常明顯，細(xì)胞質(zhì)顆粒脫落，細(xì)胞核出現(xiàn)裂解，胞漿溶解，大量細(xì)胞碎片。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)莪術(shù)油能夠抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的增殖，并初步觀察到細(xì)胞死亡的大體形態(tài)學(xué)變化，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。