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自體和異體骨移植技術不同程度的修復了骨缺損，仍達不到最理想的修復層次，目前研究最熱門的是骨組織工程聯合前沿的生物材料和細胞生物學技術試圖達到理想層次骨修復，將損失減少到最小。

1組織工程修復骨缺損進展

骨組織工程可追溯到urist［10］1965年報道的用DBM(骨形態發生蛋白)誘導間充質細胞形成進而分化為成骨細胞。直到1987年在美國紐約的學術會議上才正式提出組織工程學定義，其目的和意義是在細胞水平和分子水平構建具有生命力的細胞生物材料復合體，從形態、結構和功能上對缺損或功能障礙的組織、器官進行永久性地置換及替代，實現組織器官的形成及再生。組織工程學的不斷創新使骨缺損的研究有了突破，使得骨移植后有骨生成、骨誘導、骨重建、骨修復作用。目前，骨組織工程學有不同的復合形式，生物材料復合成骨細胞和生長因子則是近年來的研究熱點。近年來骨組織工程所用的生物材料也是多種多樣，各具特點，與骨組織工程、基因工程聯合應用研究越來越多，可以做到互補。如陶瓷材料的生物力學性能和骨誘導不足可以被轉基因處理的細胞分泌生長因子所彌補，生物材料可增加骨傳導和穩固性，提供適宜的環境促進細胞增殖與分化［11］。Dupont等［12］用合成支架涂層聯合腺病毒承載的BMP-2用于修復骨缺損，結果顯示復合生物材料脫細胞移植有良好的骨誘導能力。生物陶瓷獨特的多孔結構模擬骨松質可以加速缺損部位的血管化有利于運輸營養，加上生物材料本身不同程度的可溶性和降解性，可有不同時間段的吸收后骨重建。目前，研究最多的陶瓷材料是多孔性的羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)，它同生物玻璃都屬于活性生物陶瓷。由于HA的強度并不高，多用于強度較低的骨缺損修復，如頜面部外傷缺損。珊瑚是HA的代表，近年來僅作為填充物應用于臨床，而忽視了其可作為生物工程支架和載體的作用［13］。另外一種廣泛應用的是β-磷酸三鈣(β-TCP)，其最大的優勢是植入機體后生物相容性好，所以也稱為生物吸收性材料，局部反應和全身毒性反應都比較少見，降解的速度也較HA較快(主要與TPC的表面結構，晶體類型與比例，孔隙率和臨床科研的動物有關)。孔隙率是75%的TPC是最好的骨替代材料，但同樣是因為強度不夠，而只能用于不負重骨部位［14］。磷酸鈣陶瓷在體內的代謝途徑目前認為是粒子而不是離子，所以長時間聚集可能會造成淋巴結增生。磷酸鈣骨水泥可用作復合材料成分之一，承擔組織工程中載體作用，顯示出在細胞保護、增殖、堿性磷酸酶與骨膠原生成等方面的良好效果［15］。通過向磷酸鈣陶瓷中添加相應增強韌性的材料而形成的TPC復合材料已經成為研究熱點之一，伴隨著納米技術的引入，該種材料的學術研究和市場都會有廣闊的前景。復合生物材料用于骨組織工程也能表現一定的作用。高分子聚合物可賦予骨基質各種理化和力學特性，可分為天然聚合物如纖維蛋白、甲殼素及其衍生物和合成聚合物如乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)。骨膠原(Collagen)是骨細胞外基質成分，可以促進鈣沉積，血管內向性生長及生長因子錨定，促進骨愈合，是良好的細胞、藥物、基因、蛋白支架，也常作為黏合劑與具備骨傳導能力的載體，如羥基磷灰石或磷酸三鈣等合用發揮各組分的優勢。王浩等［16］將鼠間充質干細胞種植在骨膠原-羥基磷灰石-硫酸軟骨素復合材料上，并在體外培養增殖，再將該復合物植入大鼠肌肉內。結果顯示該復合材料的三維微孔結構可促進細胞向內生長，其在大鼠肌肉內逐步降解的同時伴有新骨形成，提示該復合物在細胞附著與誘導分化上有著良好表現。目前用于骨組織工程的目的細胞有:成骨細胞(胚胎骨或新生骨、骨膜)、軟骨細胞、骨髓基質干細胞(bonemarrowstemcells，BMSC)、人臍帶間質干細胞(HUCMSCs)、脂肪干細胞(adiposederivedstemcells，ADSCs)、胚胎干細胞(embryonicstemcells，ESCs)、轉基因細胞等，大多是自體細胞，它們能大量分泌生長因子且有多分化潛能，如將BMP基因轉染軟骨細胞后可促進Ⅱ型膠原、軟骨寡聚蛋白等的分泌［17］。BMSC存在成體骨髓內，在一定的條件下可向骨、軟骨、脂肪三系分化，培養擴增幾億倍仍可保存其分化潛能，也能長期穩定的表達外源性生長因子基因。Corn等［18］人用熒光成像的方法證實了間充質干細胞在移植后的修復作用。HUCMSCs的選擇主要集中在足月新生兒，它的特異性抗原標記仍不明確，所以移植后的效果評價還停留在流式細胞術階段。ESCs在表現其強大優勢時也暴露其負面的遺傳性，如攜帶致瘤基因，所以在未找到消除消極因素前可能會限制該細胞在臨床上的應用。ADSCs體外培養易成活，免疫特性低，還具有刺激組織細胞分泌血管生長因子作用而被廣泛認可，其發展也最有前景。成骨細胞因易老化等缺點而被淘汰。盡管倫理、干細胞界定、分離和增殖上仍有挑戰，但干細胞在組織再生方面的臨床價值值得探索。

2基因工程修復骨缺損進展

1973年開始，基因治療已經不局限于遺傳病的治療，隨著對生長因子基因的不斷認識與克隆，人們想到將內源性生長因子穩定有效地表達在骨缺損部位用于骨愈合的治療，尤其是在缺乏血管和神經的關節軟骨缺損修復過程中應用更為必要。Sheyn等［19］將基因修飾的干細胞用于椎體骨修復的模擬實驗結果顯示骨缺損得到良好修復，彌補了外科手術的不足。治療骨缺損基因工程所需要的目的基因主要是一些生長因子基因:骨形態生成蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、轉化生長因子(TGF)、血管內皮生長因子(VEGF-A、B、E促進血管以出芽的方式生成，VEGF-C、D則促進淋巴管生成)、甲狀旁腺素(PTH)等。目前，已經認識到骨缺損愈合的過程中是多種生長因子共同參與、協同作用，共同促進愈合。已經有實驗證明多生長因子基因聯合作用較單個基因在促進成骨時更有效［20-21］。研究最多的是BMP超家族的成員，它是骨修復生長的啟動基因，誘導成骨細胞生成，對未分化的骨髓干細胞有促進增殖和分化的作用，對成熟的細胞無作用。同時能促進骨折部位的穩定［22］，即使在炎癥因子存在時也能顯著誘導骨基質形成。BMP通過細胞膜上的Ⅰ型、Ⅱ型受體(都是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超家族成員)，在細胞外聚集并通過Smad將信號轉入胞內，引發骨生成［23］。例如，將外源性BMP2基因轉染從機體上分離出的靶細胞，進行體外培養，然后再轉移到缺損部位進行骨誘導修復即體外轉染途徑，或者基因表達載體直接注入機體靶細胞促進修復即體內轉染途徑。轉染BMP2基因常選用的載體有病毒載體如腺病毒(a-denovirus，Ad)和非病毒載體如pcDNA3、pBK-B2、pEGFP等。YossiGafni等［24］利用腺病毒載體轉染大鼠的骨髓基質細胞，利用骨缺損處成骨反應時產生的放射線觀察得到證實。Clements等［25］用載有堿性生長因子的質粒轉染BMSC結果證明了非病毒載體的可行性。相比較而言體內轉染途徑在臨床上更容易實施，因體內轉染途徑不僅能較好表達生長因子且能避免病毒傳播和免疫反應的副作用［26］。只是在臨床中會遇到這樣的問題:注射到局部的BMP會被滲出的體液沖散而引來吞噬細胞且靶細胞的選擇不容易控制，降低了生長因子的作用效率。目前采用超生介導的體內轉染操作簡單可指導臨床應用，體外轉染也有其明顯優勢，高效的細胞轉導，操作簡便，還可與骨組織工程結合來完成骨修復，將來源于自身組織的細胞復合組織工程載體，然后經過細胞生物反應體系培育，再轉移到宿主能夠減少生長因子被蛋白酶水解提高移植質量，如rhBMP-2聯合膠原蛋白海綿載體，但BMP-2用量會是生理需要的1000倍，帶來經濟負擔和不良反應如水腫、異位成骨等。于是，有人選用與BMP-2生物活性相似的生物活性肽P24來代替rhBMP-2，實驗結果表明有明顯的成骨效應［27］。需要注意的是，不是越多的生長因子表達就越好，如VEGF過度表達會引發骨重建環境的不穩定，增加骨降解［28］。載體承擔傳遞基因的作用，要根據骨缺損的大小、位置等來選擇合適的基因工程載體。病毒載體以腺病毒(Ad)應用最多，因為本身就具有致病性所以制備起來復雜，安全度低且有免疫反應(原因是病毒表面的抗原暴露在靶細胞的表面)，但轉染率高還能控制BMP的過量表達。有人用藥物來阻止免疫反應從而減輕病毒載體的免疫損害，結果顯示免疫抑制后靶細胞仍然可以表達目的基因進行骨誘導［29］。而非病毒載體雖然低毒、不會引發較強的免疫反應，也比較穩定可重復多次使用，但轉染率相對較低。有文獻報道生長因子表達的時間和量都是影響基因治療的因素，所以新開發的慢病毒介導BMP2表達時間要長于Ad介導的表達時間［30］。基因轉染的生化方法主要有磷酸鈣介導的轉染、二乙氨乙基聚糖介導的轉染(DEAE)及脂質體介導的轉染等。其中，由脂質雙分子層組成環狀封閉囊泡的脂質體多用，它與DNA形成脂類復合物，通過入胞方式使基因轉入細胞。不同的脂質體也有不同特點，Lipofecamine對于一些難轉染的細胞轉染效率高，但細胞毒性較大;Fugene6細胞毒性小，轉染效率高，操作簡單，已經占了主導地位。當然，轉染也有物理方法，包括電穿孔法和顯微注射法，后者就是直接用微吸管吸取DNA液，在顯微鏡的幫助下，注射到目的細胞或者靶細胞的細胞核中，操作的技術要求較高。

3兩種方法的聯合應用

組織工程在骨缺損修復中雖然有前景，但目的細胞在體外培養時極易老化，從而喪失增殖和分化能力。所用目的細胞體外培養的需要量大，且必須加以誘導才能促使其向成骨細胞分化，而多次注射生長因子代價也會很高。基因工程雖然在骨誘導方面有很大的優勢，但是體內轉染途徑的靶細胞不好定位，體外轉染途徑若是不聯合骨組織工程，缺損部位的骨強度不夠會影響近期支撐功能。目前采用基因工程聯合骨組織工程可以有效防止細胞老化，并且能使細胞長期有效地表達生長因子，避免重復注射生長因子，而且基因工程所表達的是內源性的生長因子，生物活性比外源性的更強，更有利于干細胞向成骨細胞的分化，加速新生骨的形成，另外組織工程也可彌補基因工程骨傳導不良的缺陷。大片移植骨時，即使是運用了各種有孔生物支架或是直接將內皮細胞和骨髓干細胞放在試管內培育，工程骨的血管生成與骨誘導同時有效仍然是個沒有攻克的難題，難免會顧此失彼。最近有報道將RunxⅡ基因轉染的脂肪干細胞聯合血管束一同移植到骨缺損部位結果顯示有良好的骨再生和血管形成能力［31］，所以雖然兩種工程看似是單獨個體，卻可以聯合起來引領骨缺損的治療方向。

4展望

綜上所述，人類在骨缺損修復治療上已經有新的突破，最近胸腺肽-β、整合素α5等［32-33］也被挖掘認為與骨再生有關，可見未來會有更多的積極因素被發現，只是不同的研究方法仍然存在需要解決的問題。很多成果都僅在動物模型上獲得了成功，缺乏臨床研究的實驗數據。在生物陶瓷方面，第一，孔型結構有很多優勢但也要知道這種結構會造成氧自由基、代謝物的四處擴散;第二，依照全身不同部位的骨骼特性，使陶瓷材料在制作加工的過程中，在結構、化學物質組成、性質都盡量的符合骨骼愈合過程中的變化，即讓材料在移植之后能完成一種由無生命到有生命的蛻變過程，這種過程包括材料降解之后在體內的分布和代謝;第三，生物材料的脆性和疲勞性也是一個需要解決的問題。組織工程與基因工程所用的干細胞的成骨誘導作用，在3D結構支架上的加強和引導也是一個難題。目前，無論是組織工程、基因工程還是骨移植材料都沒有一個具體的標準來衡量治療的安全性和長期有效性，如基因轉染的劑量控制標準、負面影響目的細胞增殖分化的生物因子量如白介素4等。有人研究用磁場和低能量脈沖超聲波來治療骨折不愈合和骨缺損［34］，可能與DNA結合抑制因子(ihibitorofDNAbinding4，Id4)有關［35-37］但確切的機制還不清楚。即使有許多問題都還有待于解決，但是新技術的前景是無法估量的。所有的技術都不是孤立存在的，將各種方法聯合起來應該是一種治療方向。

作者：郭宜姣李文華單位：西藏民族學院醫學院高原環境與疾病相關基因研究實驗室生命科學基礎實驗室