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摘要：采用高純度CO2和空氣的混合氣體調配試驗所需酸化海水，研究不同海水酸化條件脅迫對脊尾白蝦超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）活性和丙二醛（MDA）濃度的影響．結果表明，1000μL／LCO2酸化組SOD，CAT和GSH－Px活性表現為先上升后下降的趨勢，其中SOD和CAT活性分別在7d和14d時受到顯著誘導（P＜0．05），而GSH－Px活性在7d和14d時顯著高于對照組（P＜0．05）；1900μL／L酸化組SOD，CAT和GSH－Px活性在暴露過程中受到不同程度的抑制，其中SOD活性在14d和28d時均顯著低于對照組（P＜0．05），CAT和GSH－Px活性均在14d時受到顯著抑制（P＜0．05）；1000μL／L和1900μL／LCO2酸化組的MDA濃度均呈現先增加后回落的趨勢，1000μL／L組在14d時MDA濃度顯著增加（P＜0．05），而1900μL／L組則在7d和14d時MDA濃度均顯著高于對照組（P＜0．05）且在14d時達到最大值．由此可見，海洋酸化對脊尾白蝦的抗氧化酶活性具有明顯的刺激作用，且在輕度酸化脅迫時抗氧化酶活性受到誘導，而在較高強度的酸化脅迫時其活性被抑制．

關鍵詞：海洋酸化；脊尾白蝦；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；谷胱甘肽過氧化物酶；丙二醛

引言

自工業革命以來，化石燃料燃燒等人類活動導致大氣中CO2從工業革命前的280μL／L增長至2013年的394μL／L，增長了約40％［1］．據IPCC（聯合國政府間氣候變化專門委員會）預測，2100年大氣中CO2將會達到1000μL／L，表層海水pH將繼續下降0．3～0．4；至2300年時有可能達到1900μL／L，pH可能將再下降0．7～0．8［2－3］．多年來，人們認為海洋酸化的進程是緩慢而不易察覺的，但調查結果大大超乎人們的預料．據調查，在海洋酸化的影響下，意大利那不勒斯附近海域的有孔蟲種類急劇減少，由24種減少到6種［4］．美國Tatoosh島附近海域海水pH實際上升的平均速度也比預測的速度快10倍以上［5］．由此可見，海洋酸化正以人們無法估計的速度加劇影響著海洋化學變化，對海洋生物的生存及海洋生態系統的平衡構成嚴重的威脅．目前，對海洋酸化的研究主要集中在海洋酸化對無脊椎動物（腔腸動物、軟體動物、棘皮動物、節肢動物）及魚類的生長率、成活率、鈣化率、感官能力、繁殖能力等的影響方面［6－7］，特別是關于海洋酸化對海洋生物的受精、胚胎早期發育及幼體存活率影響開展了較多的研究．研究表明，海洋酸化會導致許多無脊椎動物的早期胚胎和幼體發育遲緩，甚至產生致畸、致死效應．劉文廣等［8］的研究結果表明海洋酸化對馬氏珠母貝的受精率無顯著影響，但會導致其幼蟲發育受阻，存活率降低．在甲殼動物中也存在類似的現象，如海洋酸化處理帝王蟹（Paralithodescamtschaticus）胚胎，結果發現有4％的眼變大和5％的卵黃變小，而且平均孵化周期延長33％；酸化處理幼體時，其存活率下降［9］．但不同物種間甚至同一物種的不同發育階段對海洋酸化的響應也存在差異．如在同樣的較高CO2濃度條件下，梅氏長海膽（Echinometramathaei）和馬糞海膽（Hemicentrotuspulcherrimus）的受精率有所不同［10］．由此可見，生長環境的差異和不同海洋生物自身機能、生活習性及發育特點等方面的不同使不同海洋生物產生了不同的酸堿調節能力，其機制也存在很大的差異．脊尾白蝦（Exopalaemoncarinicauda）是我國沿海重要的經濟蝦類之一，具有環境適應性廣、繁殖周期短、生長速度快等優點，而且能在室內通過控溫促使其繁育而不受季節的影響，可以在較短的時間內獲得不同發育時期的試驗材料．因此，脊尾白蝦是一種理想的測試生物體，可用于監測和評價海洋水體環境和質量變化．本文研究脊尾白蝦在海水酸化暴露脅迫下，體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）等酶活性的變化及其體內丙二醛（MDA）濃度的變化，評價SOD，CAT，GSH－Px和MDA作為海水酸化暴露的生物標志物的適用性，為預測未來海洋酸化對海洋生物和生態系統的影響提供依據．

1材料與方法

1．1試驗材料脊尾白蝦取自連云港忠玉水產養殖場，蝦體長（4．97±0．14）cm，體質量（2．75±0．12）g．試驗前選擇健康的脊尾白蝦放入室內水族箱中馴養7d以上，馴養期間，每日換水一次，并在自然死亡率低于2％的情況下選擇身體健康、大小基本一致的脊尾白蝦供試驗用．

1．2海水酸化暴露試驗CO2體積分數分別設定為400μL／L（對照組）、1000μL／L和1900μL／L，對應的pH分別為8．1，7．7和7．4．采用“一種獲取不同二氧化碳濃度的裝置”（ZL201720578617．0）將空氣與純CO2氣體混合得到相應CO2體積分數的混合氣體，通入到30L養殖容器的過濾（0．45μm微孔濾膜過濾）海水中，待海水酸化穩定后用于試驗．將馴養后的180尾脊尾白蝦隨機分到9個養殖容器中，每個養殖容器內放置20尾，每個CO2體積分數組設置3個重復．在酸化海水暴露期間的1，3，7，14和28d時分別取3尾蝦，解剖后取肝胰腺置于離心管中，做好標記并在－20℃冰箱中冷凍保存．

1．3組織勻漿制備及酶活性測定將各個時期取樣的肝胰腺在冰浴中與質量分數0．86％的生理鹽水（配方）用玻璃勻漿器制成質量分數10％的勻漿，4℃10000r／min離心15min，取上清液用于總蛋白、SOD活性、CAT活性、GSH－Px活性及MDA濃度測定．1．3．1總蛋白的測定采用南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮藍法總蛋白（TP）測試盒的操作步驟測定組織蛋白含量，用于計算SOD，CAT和GSH－Px酶活性及MDA濃度．1．3．2SOD，CAT和GSH－Px活性的測定按南京建成生物工程研究所提供的SOD測試盒（WST－1法）、CAT測試盒（可見光法）和GSH－Px測試盒（比色法）的操作步驟測定該3種酶的活性．1．3．3MDA濃度的測定按南京建成生物工程研究所提供的MDA測試盒（TBA法）操作步驟測定組織中MDA濃度．

1．4數據處理酶活性用“平均數±標準偏差（means±SD）”表示．試驗結果使用SPSS22．0統計軟件進行數據分析，用方差分析（ANOVA）法分析試驗組與對照組之間差異，并用Student－Newman－Keul’s檢驗法分析組間顯著性，P＜0．05表示差異顯著．

2結果與分析

2．1海水酸化對脊尾白蝦SOD活性的影響由圖1可見，隨著暴露時間的延長，1000μL／L酸化組的脊尾白蝦SOD活性表現出先上升后下降的趨勢．暴露1d和7d時1000μL／L酸化組SOD活性與對照組之間的差異并不顯著（P＞0．05）；暴露14d時酸化組SOD活性受到顯著誘導（P＜0．05）且達到最大值；暴露28d時，其SOD活性高于對照組，但差異不顯著（P＞0．05）．暴露于1900μL／L酸化組的脊尾白蝦SOD活性在暴露過程中受到不同程度的抑制．1d和7d時1900μL／L組與對照組的SOD活性無顯著差異（P＞0．05）；14d和28d時1900μL／L組SOD活性均顯著低于對照組（P＜0．05），且在14d時達到最低值．

2．2海水酸化對脊尾白蝦CAT活性的影響不同程度酸化暴露對脊尾白蝦CAT活性的影響如圖2所示．暴露于1000μL／LCO2的脊尾白蝦CAT活性表現為先升后降的趨勢，在1d時1000μL／L組與對照組的CAT活性無顯著差異；在7d時CAT活性受到顯著誘導（P＜0．05）且達到最大值；14d和28d時1000μL／L組CAT活性高于對照組，但差異不顯著（P＞0．05）．暴露于1900μL／LCO2的脊尾白蝦CAT活性隨著暴露時間延長先抑制后逐漸回升．暴露1d和7d時酸化組CAT活性略低于對照組，但差異不顯著（P＞0．05）；暴露14d時酸化組CAT活性受到顯著抑制（P＜0．05）且達到最低值；暴露28d時酸化組CAT活性低于對照組，但無顯著差異（P＞0．05）．

2．3海水酸化對脊尾白蝦GSH－Px活性的影響由圖3可以看出，隨著暴露時間的延長，1000μL／L酸化組脊尾白蝦GSH－Px活性呈現先增加后逐漸下降的趨勢．暴露1d時酸化組GSH－Px活性與對照組無顯著差異；7d和14d時酸化組GSH－Px活性顯著高于對照組（P＜0．05），且在7d時達到最大值；暴露28d時酸化組GSH－Px活性雖然高于對照組，但差異不顯著（P＞0．05）．暴露于1900μL／L酸化組的脊尾白蝦GSH－Px活性與SOD及CAT活性類似，在暴露過程中受到不同程度的抑制．1d和7d時1900μL／L組與對照組的GSH－Px活性無顯著差異；14d時1900μL／L酸化組GSH－Px活性受到顯著的抑制（P＜0．05）且達到最低值；28d時1900μL／L組GSH－Px活性低于對照組，但差異不顯著（P＞0．05）．

2．4海水酸化對脊尾白蝦MDA濃度的影響在不同CO2體積分數酸化條件下，脊尾白蝦MDA濃度變化如圖4所示．暴露于1000μL／LCO2的脊尾白蝦MDA濃度隨著暴露時間的增加呈現先上升后下降的變化趨勢．暴露1d和7d時MDA濃度與對照組無顯著差異（P＞0．05）；暴露14d時MDA濃度顯著增加（P＜0．05）且達到最大值；暴露28d時MDA濃度與對照組無顯著差異（P＞0．05）．在1900μL／LCO2酸化條件下，脊尾白蝦MDA濃度隨著暴露時間的延長表現為先增加后回的趨勢．1d時1900μL／L組的MDA濃度低于對照組但無顯著差異（P＞0．05）；7d和14d時MDA濃度均顯著高于對照組（P＜0．05）且在14d時達到最大值；28d時1900μL／L酸化組MDA濃度高于對照組，但差異不顯著（P＞0．05）

3討論

抗氧化酶系統在清除體內活性氧物質、使細胞免受氧化損傷過程中發揮著重要作用．當生物體受到外界不利因素脅迫時，其體內將產生過量的活性氧，打破機體內抗氧化防御性功能酶與活性氧自由基之間的平衡關系，過量的活性氧將攻擊各種生物大分子，引發生物膜中的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，對細胞和機體產生毒害作用［11］．SOD和CAT是生物體內兩種重要的抗氧化酶，正常情況下，SOD，CAT和GSH－Px協同作用可以有效清除脅迫所產生的活性氧自由基，從而使機體細胞免受自由基損傷［12－14］．已有研究表明，生物體的SOD和CAT等抗氧化酶在不同pH的環境脅迫下，其酶活性可能會受到誘導或抑制兩種現象．金頭鯛（Sparusaurata）在用CO2模擬海水酸化的試驗中，SOD活力隨酸化梯度呈現出規律性變化［15］．樊甄姣等［16］研究發現，略低于正常值（pH8．0）的pH脅迫下，櫛孔扇貝（Chlamysfarreri）血清中SOD和CAT活性明顯升高，但低pH（7．0）時，SOD和CAT活性受到顯著抑制．與此類似的情況在背角無齒蚌（Anodontawoodiana）中也存在，低pH（6．0）或高pH（8．5）均會使背角無齒蚌血清中SOD和CAT活性有不同程度的降低［17］；馬廣智等［18］研究發現草魚（Cteno－pharyngodonidellus）在低pH環境脅迫下SOD活性被抑制．克林雷氏鯰（Rhamdiaquelen）在pH5．0的環境下脅迫其肝、鰓和肌肉中的CAT活力也顯著低于pH7．0對照組［19］．本研究發現，1000μL／LCO2酸化組，脊尾白蝦的SOD，CAT及GSH－Px酶活性先上升后下降，3種酶活性在1d時酸化組與對照組均無顯著差異，在7d時CAT和GSH－Px兩種酶活性受到顯著誘導且達到最大值，SOD酶活性則在14d時顯著高于對照組．與此類似的是菲律賓簾蛤（Ruditapesphilippinarum）在海水CO2酸化條件下，pH7．6組的SOD活性顯著高于pH7．9對照組［20］．這是由于CO2溶解于海水后引起水體環境pH的下降，破壞了脊尾白蝦體內體液的酸堿平衡，而機體酸堿平衡失調伴隨氧化應激反應，同時激活抗氧化防御機制，從而影響抗氧化酶的活性［21］．本研究中，暴露于1900μL／LCO2酸化組的脊尾白蝦，其SOD，CAT及GSH－Px酶活性則受到不同程度的抑制；該3種酶活性在1d和7d時酸化組與對照組均無顯著差異，而在14d時這3種酶活性均受到顯著抑制且達到最低值．這可能是隨著CO2體積分數的升高，環境pH進一步降低，使機體H＋濃度增加，而多余的H＋促機體生成更多的活性氧自由基，破壞機體活性氧平衡，引起SOD等酶活性降低［21］．此外，本研究結果與李信書等［22］發現隨著Cd和Cu濃度增加亞心形扁藻（Platynonassubcordi－formis）的SOD酶活性也隨之增加，但濃度過高時反而下降的研究結論基本一致；與此類似的是，日本囊對蝦（Marsupenaeusjaponicus）在pH7．2水體脅迫下其SOD的活性隨脅迫時間延長而逐漸降低［23］．這可能是生物機體的SOD，CAT及GSH－Px等抗氧化酶活性在受到嚴重脅迫時被抑制，而在輕度脅迫時往往受到誘導而升高［24］．樊甄姣等［16］的研究結果也表明，pH在一定范圍內隨刺激強度的增加對櫛孔扇貝呈現免疫活性的正調節；但在高強度pH刺激下，免疫活性呈現出負調節，這種調節可能與高強度刺激引起的免疫機能疲勞或損傷有關．但Flexopectenglaber扇貝暴露于pH7．4的海水酸化環境中，其消化腺和鰓組織的CAT活性均高于對照組［25］，厚殼貽貝（Mytiluscoruscus）暴露于低pH（7．3）的海水酸化中時，其鰓組織的SOD，CAT和GSH－Px活性均受到顯著誘導［26］．上述研究結果表明，海水酸化對機體抗氧化酶的反應是比較復雜的，具體的機理還需更加深入研究．MDA作為脂質過氧化的終產物之一，正常生理狀態下，體內的MDA濃度是極低的，其濃度可間接反映機體的活性氧自由基和脂質的過氧化水平，從而間接反映出細胞受損傷的程度，因此MDA被廣泛地作為指示生物體內脂質過氧化程度的檢測指標［27－28］．研究表明，在有機磷農藥的暴露下，沼水蛙蝌蚪的MDA濃度會隨著暴露濃度的增加而上升［29］；磺胺類藥物暴露也會使羅非魚（Oreochromisniloticus）肝臟組織的MDA顯著提高［30］．陶易凡等［31］研究發現pH脅迫克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）時其MDA濃度在肝胰腺中的積累量會顯著增加．本研究結果顯示，暴露于體積分數1000μL／LCO2的脊尾白蝦MDA濃度先升后降且暴露14d時MDA濃度顯著增加；1900μL／LCO2時MDA濃度先增加后減少，7d和14d時MDA濃度均顯著高于對照組且在14d達到最大值；28d時其MDA濃度也略高于對照組．這可能是由于pH的脅迫會誘導機體內產生的大量活性氧自由基通過與生物膜發生脂質過氧化反應，從而產生大量的MDA［17］，而且隨著pH的進一步降低，抗氧化酶SOD，CAT和GSH－Px活性明顯降低，使脅迫過程中產生的活性氧堆積而導致MDA濃度不斷增加，導致機體免疫功能的進一步下降或受損。

作者：李晨輝 王夢杰 彭艷青 高煥 王懷忠 王海華 陳建華 單位：淮海工學院