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摘要:應用高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)、頂空-氣相色譜-質譜(HS-GC-MS)和近紅外光譜(NIRs)技術,對三個產地5個批次中藥郁金的水提物和揮發油,分別進行檢測并構建郁金部分組分/全組分指紋圖譜,采用統計學方法和模式識別方法(KK-Anal-ysis),構建預測模型。結果顯示不同批次不同產地的郁金藥材存在差異,GC指紋圖譜顯示:對于揮發油組分而言,郁金藥材之間最大的差異來自不同的品種,而相近的批次對它們的影響要小;HPLC指紋圖譜則給出了有意義的結果:四川2016和四川2017批次水提物幾乎無差別,但廣西2016和廣西2017批次差別較大,很明顯廣西2017和浙江2017批次郁金藥材的水提物質量相似并優于廣西2016批次。NIRS全組分指紋圖譜同樣顯示不同產地不同批次郁金藥材存在差異,應用最小二乘-支持向量機(LS-SVM)進行識別,測試集識別率為100%,驗證集識別率為94.7%。

關鍵詞:中藥;郁金;指紋圖譜;模型預測

中藥以其藥效作用多樣和低毒而聞名,而隨著對中藥認知度的不斷提高和使用,中藥正在走向世界并逐漸為國內外民眾所認可。郁金是較早使用的中藥材,并被記錄于蘇敬的《唐本草》,用藥歷史距今已有1400年。郁金廣泛用于活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、殺菌、抗病毒和抗炎。其主要的兩大活性組分為姜黃素類化合物和揮發油類化合物。地域對中藥材的藥性影響很大,通常把較其他產區的同種藥材品質更佳、療效更好,并具有較高知名度的藥材稱為道地藥材[1]。四川產郁金被稱作為郁金的道地藥材,廣西、云南、浙江一帶也都產郁金藥材,但質量不如四川產郁金。由于價格等因素市場上可能流通著以次充好的郁金藥材,而且一般很難用肉眼來進行產地鑒別。不同于西藥的單一組分,多數中藥藥效由多種藥效組分配伍而發揮其治療的作用,因此中藥的質量控制和質量保證還存在一定困難和挑戰。指紋圖譜技術被認為是分析復雜中藥材的重要方法,在化學統計學的幫助下,能從其指紋圖譜中挖掘復雜體系的有效信息,去冗求簡,并構建準確快速識別的數據庫[2-3]。高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)和氣相色譜-質譜(GC-MS)由于具有通用、穩健和可重復性,常被用來鑒定復雜物質(例如中藥和食品)的組成或有效成分、品質和真偽。特別是HPLC和GC具有非常強的分離能力,因此,由這兩種色譜方法構建的樣品指紋圖譜可以清晰確認某一種或幾種化合物成分在復雜物質定性中的作用[4-5]。Qin等[6]應用GC-MS法研究了黃絲郁金(C.Longa)、蓬莪術(C.Phaeocaulis)、溫郁金(C.Wenyujin)和廣西莪術(C.Kwangsiesis)的塊根和根莖,并發現了四種標志物芳姜黃烯(ar-Curcumene)、芳姜黃酮(ar-Turmerone)、α-姜黃酮(α-Turmerone)和β-姜黃酮(β-Turmerone)對塊根和根莖的鑒別起到了重要作用。Li等[7]應用HPLC-MS法定性定量分析郁金藥材中的姜黃素類化合物,發現不同產地和不同栽培年限藥材中姜黃素類化合物的含量差別較大。Ni等[8]應用GC-MS法和HPLC法研究復雜物質(莪術)并構建其色譜指紋圖譜,經統計學方法處理后,兩類數據得到比較好的融合,從而提高了對莪術樣品采用指紋圖譜進行判別鑒定的準確性。近紅外光譜(NIRS)測定具有快速、無損、需要樣品量少、能實時監測等特點,目前已被廣泛應用于工農業生產過程中復雜物質的檢測和鑒定。NIRS測量的是有機分子中含氫基團(-OH、-NH、-CH)振動的合頻和各級倍頻峰吸收,因此其構建的指紋圖譜能表達某類或幾類化合物的加和作用。NIRS的復雜性決定其依靠善于處理復雜信號、挖掘隱藏信息、可視化分析結果的統計學方法來解析[9-10]。本文應用高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)和頂空-氣相色譜-質譜法(HS-GC-MS)分別測定郁金藥材水提物和揮發油的化合物組分;并應用HPLC、GC和NIR分別構建郁金藥材指紋圖譜,以期有的放矢高效用好中藥藥材。

1實驗部分

1.1郁金樣品的采集本研究共采集了三個產地的53份郁金樣品,其中四川2016批次8份(1#~8#),四川2017批次12份(9#~20#),廣西2016批次8份(21#~28#),廣西2017批次10份(29#~38#),浙江2017批次15份(39#~53#)。

1.2樣品前處理將郁金樣品打碎并過40目篩后,保存于自封塑料袋中,并盡快完成HS-GC-MS和NIRS檢測。樣品的HPLC-MS測定前處理如下:準確稱取1.00g郁金粉末樣品,加入20mL二次蒸餾水,于50℃超聲30min,之后將提取物過濾于25mL容量瓶中。液相色譜進樣前,將提取物過0.45μm的濾膜。

1.3檢測儀器及參數設置NIRS測定:日立UV-4100紫外-可見-近紅外光譜儀,反射模式,掃程200~2500nm,掃描步長2nm,每個樣品掃描32次取其平均吸光度值。HS-GC-MS測定:配備島津AOC5000頂空自動進樣器的島津QP2010GC-MS儀,RTX-5毛細柱(30m×0.25mm,0.25μm)。HS參數如下:溫度100℃,500r/min轉動25min。GC參數如下:進樣體積250μL,流速1.0mL/min,進樣口溫度230℃,柱溫程序,初始70℃(保持5min),以10℃/min升溫至140℃(保持2min)。MS測定參數如下:接口溫度230℃,掃描范圍m/z30~500,掃描頻率0.30scan/s。HPLC-MS測定:WatersAQ4000/2695HPLC-MS儀,ZorbaxEllicpsePus-C18l柱(250×4.6mm,5μm),流速1.0mL/min,柱溫20℃,檢測波長270nm,進樣體積20μL。流動相及梯度如下:流動相為甲醇(A)和0.1%H3PO4(B),0~4min,95%~90%B;4~30min,90%~50%B;30~50min,50%~8%B;MS條件如下:電噴霧離子化檢測器,解離溫度350℃,離子源溫度110℃,掃描范圍m/z50~1000。

1.4化學統計學分析由以上測試所得的郁金樣品數據,包括NIRS、GC和HPLC,均在Matlab7.0平臺上完成統計運算。在本研究中,我們采用了KK-分析法(KK-Analysis)對測量數據進行分析。KK-分析法是基于Matlab語言并包含多種無監督模式識別方法,如自組織地圖(SOM)和聚類分析。其原理如下[11]:SOM首先由TeuvoKohonen提出,因此也稱做Kohonen地圖,它是一種將原始的多維數據壓縮成更低維數據的方法,這種壓縮技術叫做向量量化;SOM創造一個包含數據集模型的拓撲關系的信息網絡。SOM是由很多節點組成的,每個節點被分配一個權重向量Wi;在某種意義上節點組成一個小的群落;Wi和原始的特征向量具有相同的維度。迭代步驟如下:核心步驟就是鑒定距離真實輸入數據最近的節點,以及對于第j個模型來說的最佳匹配單元(BMU)。一旦確定了BMU,它的權重就按照所謂的學習率逐漸調整。權重的調整過程如下:Wi(t+1)=Wi(t)+φ(Δ,t)λ(t)(WI(t)-Vj(t))(2)式中φ是描述依賴節點升級的距離,而φ(Δ,t)是BMU的最大值。聚類分析可以分為無級區分和分級區分兩種技術,本文應用到的是無級區分策略,這種模式下需要預定義樣品分為幾個類,每次預定義的類數目發生改變,整個聚類過程將重新開始。在模糊聚類分析中,在一定程度上每一個模型都有可能屬于任何一個可能的類,因此一個模型到底屬于哪個類是通過向量表達的。這個區分過程是通過一個矩陣M×K表示的,M是整個數據機的模型數目,K表示類數目。區分的優化過程是通過最小化目標函數實現的。

2實驗結果

2.1HPLC-MS水提物組分分析和統計學將HPLC色譜數據結果導入指紋圖譜相似度軟件進行分析,發現三個產地5個批次的郁金樣品共有21組共有峰(標記為L1~L21),見圖1(a)。經過MS分子量以及組分最大紫外吸收的比對,有12個組分被鑒定(表1),分別是:沒藥姜黃醇B(BisacuroneB)(L2),姜黃素(Curcumin)(L4),去甲氧基姜黃素(De-methoxycurcumin)(L5),二去甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin)(L6),莪術醇(Curcumol)(L7),吉馬酮(Germacrone)(L11),芳姜黃酮(Arturmerone)(L12),莪術二酮(Curdione)(L13),莪術醇(Curcume-nol)(L15),異莪術醇(Isocurcumenol)(L16),姜黃醇酮(Curcolone)(L18),姜黃醇(Curcumone)(L19)。將21組共有峰數據作為變量輸入Matlab作為平臺的KK-分析法,進行聚類分析,結果見圖2(a)。發現53個樣品大致分為三類,其中四川2016和2017兩批次樣品歸為一類,廣西2017和浙江2017批次樣品水提物差別不大,廣西2016批樣品獨自為一類;另外浙江2017批4個樣品(41#,44#,51#和53#)和廣西2016批次樣品較為相似。

2.2HS-GC-MS揮發油組份分析和統計學將HS-GC測定數據導入指紋圖譜相似度軟件分析,發現三個產地5個批次的郁金樣品具有14組共有峰(標記為G1~G14),見圖1(b)。經過GC-MS化合物相似度軟件查詢并與文獻作比對,這14個化合物分別確定為:3-蒈烯(3-carene)(G1),α-蒎烯(α-Pinene)(G2),莰烯(Camphene)(G3),β-蒎烯(β-Pinene)(G4),桉油精(Eucalyptol)(G5),樟腦(Camphor)(G6),龍腦(Borneol)(G7),石竹烯(Caryophyllene)(G8),α-檀香醇(α-Santalol)(G9),α-石竹烯(α-Caryophyllene)(G10),β-人參烯(β-Panasinsene)(G11),臭樟腦(Napthalene)(G12),廣藿香烯(Patchonlene)(G13),異香樹烯(Isoaromadendren)(G14)。將14個共有峰作為變量,利用前述KK-分析法做聚類分析,結果見圖2(b)。發現三產地5批次的53份郁金樣品大致分為三類,其中四川2016和2017批次郁金樣品的揮發油組分含量較為相似,廣西2016和2017批次的樣品差別不大,浙江2017批次獨成聚為一類,另外浙江2017批次3個樣品(44#,51#和53#)不能和四川的樣品區分。

2.3NIRS全組分分析和統計學由于樣品的近紅外光譜測量易受溫度、散射和顆粒不均勻等因素的影響,故我們采用標準正態變量變換(SNVT)來校正測得的NIRS曲線(圖1(c))[12]。進而將全光譜作為變量做統計分析,結果見圖2(c)。三產地5批次的郁金樣品可分為5類:四川2016批次,四川2017批次,廣西2016批次,廣西2017批次和浙江2017批次。同時我們可以看到浙江2017批次中,39#和廣西2016批次較相似,44#和四川2017批次較相似,53#和廣西2017批次分為一組。可見不同產地不同批次間確實存在一定的差異。為了驗證無監督模式識別結果的準確度,我們將每組樣品按2:1隨機分為校正集組(四川2016批次5個,四川2017批次8個,廣西2016批次5個,廣西2017批次7個,浙江2017批次10個)和驗證集組(四川2016批次3個,四川2017批次4個,廣西2016批次3個,廣西2017批次-3個,浙江2017批次5個)。應用經典的有監督模式識別方法最小二乘-支持向量機(LS-SVM)[13]處理校正組數據并建立驗證模型,進而用于對校正組和驗證組分別進行識別,可以發現校正組樣品識別率為100%,而驗證組識別率為94.7%(參數gam=27.21,sig2=105.84)。

3結論

本研究應用HPLC-MS和GC-MS分別分析中藥郁金的水提物和揮發油,26個化合物組分被準確鑒定。HPLC指紋圖譜發現四川2016和2017批次水提物幾無差別,但廣西2016和2017批次差別較大。很明顯依據郁金藥材水提物的分析結果發現廣西2017和浙江2017批次的郁金藥材質量高于廣西2016批次。由GC指紋圖譜發現四川2016和2017批次揮發油類物質之間差別不大,而廣西2016批次和廣西2017批次揮發油類物質含量較相似,浙江、廣西和四川3個產地郁金藥材的揮發油成分含量各不相同。本研究結果在醫院臨床實踐或者工廠配方制劑生產過程中可起到參考價值,以提高和控制產品的質量。本研究還應用NIRs對中藥郁金的全組分測定,經統計學方法移除基線漂移和矯正散射影響后,構建NIRs指紋圖譜,由NIRs解析的結果表明3個產地5個批次的郁金藥材存在組分間的差異,可以被鑒定并區分。

作者：李寶輝 李冬暉 倪永年 單位：解放軍989醫院中心實驗室