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《合成化學(xué)雜志》2016年第四期

摘要:

以N，N-二甲基乙醇胺和N，N-二乙基乙醇胺為初始原料，分別與不同碳鏈長(zhǎng)度的溴代烷烴回流反應(yīng)合成了6個(gè)新型的季銨鹽型膽堿衍生物(3a～3f)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV-Vis，1HNMR和HR-MS表征。初步抗瘧活性測(cè)試結(jié)果表明:3a～3f對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)3D7的增殖均有一定的體外抑制活性，(1-羥基)二乙基正丁基溴化銨(3f)的活性最強(qiáng)［IC50(68．1±6．5)nmol•L－1］，但低于青蒿素［IC50(5．7±1．54)nmol•L－1］。

關(guān)鍵詞:

乙醇胺;溴代烷;季銨鹽;膽堿衍生物;體外抗瘧活性

瘧疾作為全球最突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題一直備受關(guān)注，而抗瘧藥物耐藥性的出現(xiàn)則是近年來(lái)亟待解決的重要問(wèn)題，研究新型抗瘧藥物具有重要的臨床意義［1－2］。研究［3］發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲(chóng)侵染宿主紅細(xì)胞之后，為實(shí)現(xiàn)其快速生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)需要，會(huì)在感染紅細(xì)胞膜上產(chǎn)生特異性代謝途徑，誘導(dǎo)其表面產(chǎn)生紅細(xì)胞膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體(erythrocytecholinecarri-ers，ECCs)［4－6］，以主動(dòng)識(shí)別和攝取宿主血清中的膽堿(主要是磷脂酰膽堿)，作為合成細(xì)胞膜磷脂的原料。正常哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞很少或幾乎沒(méi)有磷脂合成能力，因此，若以感染紅細(xì)胞內(nèi)磷脂代謝作為抗瘧藥的靶點(diǎn)，可望實(shí)現(xiàn)對(duì)紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)的靶向性，而避免對(duì)正常紅細(xì)胞的毒性。Peyrottes等［7］報(bào)道一些膽堿衍生物可通過(guò)ECCs特異性地蓄積于瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞內(nèi)，阻斷磷脂酰膽堿的合成，表現(xiàn)出顯著的抗瘧活性。

Marie等［8］報(bào)道一些膽堿衍生物對(duì)于惡性瘧原蟲(chóng)的增殖有抑制作用，且其中季銨鹽型膽堿衍生物的抗瘧活性明顯高于伯、仲、叔胺類膽堿衍生物。本文以N，N-二甲基乙醇胺(1a)和N，N-二乙基乙醇胺(1d)為初始原料，分別與不同碳鏈長(zhǎng)度的溴代烷烴(2a～2c)回流反應(yīng)合成了6個(gè)新型的季銨鹽型膽堿衍生物(3a～3f，Scheme1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV-Vis，1HNMR和HR-MS表征。并以青蒿素為陽(yáng)性對(duì)照考察了其對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)3D7生長(zhǎng)繁殖的抑制作用。

1實(shí)驗(yàn)部分

1．1儀器與試劑BrukerAvance600型超導(dǎo)核磁共振儀(氘代氯仿為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));LTQOrbitrap型高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀;ThermoScientific311型CO2培養(yǎng)箱;VariskanFlash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀。N，N-二甲基乙醇胺，N，N-二乙基乙醇胺，溴乙烷，溴丙烷和溴丁烷，阿拉丁試劑有限公司;丙酮、無(wú)水乙醇、甲醛和氫氧化鈉，天津北辰方正試劑廠;十六烷基三甲基溴化銨、四苯硼鈉和達(dá)旦黃，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司;青蒿素，重慶華方武陵山制藥有限公司;4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、次黃嘌呤、山梨醇和皂苷(Saponin)，美國(guó)Sigma公司;富脂牛血清白蛋白(AlbumaxⅡ)和RPMI1640，美國(guó)Gibco公司;SYBRGreenⅠ和二甲基亞砜(DMSO)，北京Biotiopped公司;人O型紅細(xì)胞和AB型血漿，山西省太原市紅十字血液中心;惡性瘧原蟲(chóng)3D7株，昆明醫(yī)科大學(xué)楊照青教授惠贈(zèng)。

1．23a～3f的合成通法在反應(yīng)瓶中依次加入取10．1mol和無(wú)水乙醇100mL，攪拌使其溶解;逐滴加入20．12mol，加畢，于室溫反應(yīng)30min;回流反應(yīng)24h。趁熱抽濾，濾液旋蒸除溶得無(wú)色稠狀液體，加丙酮35mL溶解，冷卻至室溫，于－20℃靜置2h，抽濾得白色針狀晶體，重復(fù)上述操作3次得白色固體3a～3f，產(chǎn)率70%～80%。

1．3純度測(cè)定采用四苯硼鈉返滴定法［9］對(duì)3a～3f的純度進(jìn)行測(cè)定。稱取0．1g待測(cè)化合物置于100mL錐形瓶中，用100mL去離子水溶解;依次加入0．1mol•L－1四苯硼鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液3mL，甲醛5mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的NaOH溶液200μL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．1%的達(dá)旦黃指示劑200μL，搖勻，用0．5mmol•L－1十六烷基三甲基溴化銨溶液滴定至終點(diǎn)(溶液由淡黃色變?yōu)榈凵?，計(jì)算各季銨鹽型膽堿衍生物純度。

1．43a～3f對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)3D7的抑制試驗(yàn)將3a～3f分別用DMSO溶解并制成10倍濃度梯度(1～105μmol•L－1)藥液，采用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋1000倍(1～105nmol•L－1)。采取100%壓積的新鮮紅細(xì)胞(RBC)對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)3D7培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，控制瘧原蟲(chóng)感染率為0．3%～0．5%，并用RPMI1640培養(yǎng)基將感染了惡性瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞壓積調(diào)至2%。96孔測(cè)定板每孔加入20μL含藥培養(yǎng)液和80μL惡性瘧原蟲(chóng)3D7培養(yǎng)物，分別設(shè)置陰性對(duì)照組(20μL含0．1%DMSO的培養(yǎng)基和80μL壓積為2%且瘧原蟲(chóng)感染率為0．3%～0．5%的紅細(xì)胞)和陽(yáng)性對(duì)照組(20μL相應(yīng)濃度梯度的ARTDMSO溶液和80μL壓積為2%且瘧原蟲(chóng)感染率為0．3%～0．5%的紅細(xì)胞)，每種膽堿衍生物設(shè)6個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次。用SYBRGreenⅠ微量熒光法［10－11］測(cè)定3a～3f對(duì)瘧原蟲(chóng)增殖的抑制作用，并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2結(jié)果與討論

2．1合成與表征在3a～3f的合成中，與溴代正丁烷不同，溴乙烷和溴代正丙烷均為對(duì)溫度和光線極為敏感的小分子烷烴，易揮發(fā)，故以這兩種溴代烷烴為原料合成膽堿衍生物時(shí)，溴乙烷室溫避光，溴代正丙烷于60℃避光，且反應(yīng)時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)(約48h)。3a～3f屬于離子型的化合物，與初始原料叔胺相比，水溶性增大，故選擇丙酮作溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，以除去未反應(yīng)完全的叔胺。旋蒸除去溶劑得黏稠狀液體，溶解于35mL丙酮中，適當(dāng)加熱使其完全溶解，攪拌均勻，冷卻至室溫，于－20℃靜置2h得目標(biāo)化合物的白色針狀晶體。考慮到長(zhǎng)鏈烷烴的空間位阻效應(yīng)可能導(dǎo)致膽堿衍生物不能很好的被DCC識(shí)別，故本試驗(yàn)合成6種短鏈小分子季銨鹽型膽堿衍生物3a～3f，它們均具有良好的溶解性，易溶于乙醇和水等溶劑。該反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，環(huán)境污染小，且各膽堿衍生物產(chǎn)率均大于70%，純度大于80%。UV-Vis測(cè)定結(jié)果表明:3a～3f的最大吸收波長(zhǎng)從408nm紅移至485nm，證明了3a～3f中季銨離子的存在。3a～3f的HR-MS分析結(jié)果顯示其精確質(zhì)量分?jǐn)?shù)［M－Br］+(m/z)實(shí)測(cè)值與理論值誤差值均小于5×10－6，且不飽和度、元素組成等均與其結(jié)構(gòu)式相符，說(shuō)明3a～3f為Scheme1預(yù)期產(chǎn)物。

2．2體外抗瘧活性3a～3f對(duì)瘧原蟲(chóng)增殖的IC50分別為5．74±1．54，732±45．9，529±38．1，385±27．3，369±29．6，318±21和68．1±6．5nmol•L－1。采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)將3a～3f的IC50與對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3a～3f的IC50與陽(yáng)性對(duì)照組相比均不同程度的升高(P＜0．05)。不同濃度的短鏈烷烴取代膽堿衍生物作用72h后對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)3D7的抑制作用與陰性對(duì)照組相比均升高(P＜0．05)。各濃度的短鏈烷烴取代膽堿衍生物對(duì)3D7的抑制作用均隨濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出不同程度的劑量依賴性。3a～3f對(duì)3D7增殖的平均抑制率變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。研究結(jié)果表明:3a～3f對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)3D4的增殖均具有不同程度的抑制作用，且對(duì)瘧原蟲(chóng)增殖的抑制率隨劑量的增高而不同程度地增強(qiáng)。比較IC50發(fā)現(xiàn)，3d～3f對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)3D7增殖的抑制作用較強(qiáng)，這可能是由于N+上取代基為乙基時(shí)，更容易被惡性瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞上ECCs識(shí)別而攝取。在一定范圍內(nèi)，隨著R3碳鏈長(zhǎng)度增加，目標(biāo)化合物對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)3D7增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，可能是由于碳鏈加長(zhǎng)，化合物脂溶性增加，與瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞細(xì)胞膜的作用增強(qiáng)。因此，該研究結(jié)果為季銨鹽型膽堿衍生物抗瘧活性構(gòu)效關(guān)系的深入研究以及通過(guò)結(jié)構(gòu)改造合成具有更高抗瘧活性的季銨鹽型膽堿衍生物提供了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

3結(jié)論

以N，N-二甲基乙醇胺和N，N-二乙基乙醇胺為初始原料合成了6種新型季銨鹽型膽堿衍生物(3a～3f)。初步抗瘧活性考察結(jié)果表明:3a～3f對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)3D7的增殖均具有一定的抑制作用，其中(1-羥基)二乙基正丁基溴化銨(3f)的抑制作用最為突出，推測(cè)其抗瘧活性可能與N+上的取代基類型有關(guān)，進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和深入研究有待進(jìn)行。

作者：王芳 趙青 程慧芳 張淑秋 單位：山西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院