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《日用化學(xué)工業(yè)雜志》2014年第五期

1實驗部分

1.1主要儀器及試劑SynergyH1全功能微孔板檢測儀(檢測儀序列號269900)，美國伯騰公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科技有限公司;移液器，賽默飛世爾公司。青?；【鶴67凍干粉，華東師范大學(xué)提供;超純水，Minipore公司;甲醛，色譜純，默克公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌劑復(fù)蘇與培養(yǎng)1)取適量－20℃保存的青?；【鶴67凍干粉，加入5mL0.85%(質(zhì)量分數(shù)，下同)的NaCl溶液，充分混合后于20℃放置15min，使青?；【鶴67恢復(fù)穩(wěn)定發(fā)光，所得菌液待用。2)培養(yǎng)基:混合鹽10.0g，硫酸銨4.2g，葡萄糖10.0g，甘油3.0mL，胰胨1.0g，加水至1L，pH=8.5?；旌消}:MgSO45.07g，MgCO32.25g，MgCl20.19g，CaCO30.06g，KCl0.44g，NaCl16.59g，KBr0.24g。將培養(yǎng)基置于500mL錐形瓶中，塞上棉球，用牛皮紙包扎好，經(jīng)121℃高壓滅菌20～30min后備用［4］。固體培養(yǎng)基:培養(yǎng)基加2%瓊脂即為固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基電爐加熱使溶解至透明，趁熱用漏斗分裝于試管中，每支試管裝至1/3，塞上棉球，用牛皮紙包扎好，經(jīng)121℃高壓滅菌20～30min后取出制成斜面。將青?；【鶴67凍干粉用0.5mL0.85%的NaCl溶液溶解，迅速轉(zhuǎn)入50mL培養(yǎng)基中，22℃恒溫培養(yǎng)，每24h后轉(zhuǎn)接一次斜面，將培養(yǎng)好的第三代斜面置4℃冰箱中備用。3)檢測用菌液制備:將培養(yǎng)好的菌種接入含有固體培養(yǎng)基的平板中，22℃恒溫培養(yǎng)12～18h后加5mL0.85%的NaCl溶液至青?；【鶴67平板中，適當(dāng)振蕩將菌體沖下，以漩渦振蕩器將菌液搖勻，測定其吸光度值，并用0.85%的NaCl溶液將細菌濃度調(diào)節(jié)至合適范圍后備用。

1.2.2標(biāo)樣配制及樣品處理標(biāo)樣配制:用超純水將甲醛配制成一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，再用超純水分別稀釋至6個質(zhì)量濃度，根據(jù)先前的試驗結(jié)果，使得6個質(zhì)量濃度的甲醛溶液產(chǎn)生的發(fā)光強度抑制率在0～100%均勻分布。樣品處理:準(zhǔn)確稱取1.0g預(yù)先混勻的樣品于10mL磨口具塞比色管中，加入1mLTween80，加0.85%的NaCl溶液至10mL，輕搖至樣品充分溶解，用0.45μm濾膜過濾，待用。

1.2.3甲醛的毒性檢測向96孔板中的A1孔加入200μL的超純水(作為本底)，A2孔加入200μL的超純水(作為空白對照)，A3—A8孔分別依次加入上述甲醛標(biāo)樣，再于A2—A8孔中分別加入1.2.1所得菌液50μL(或100μL)，在B和C排做平行樣，然后放入SynergyH1檢測儀中，檢測5，10，15和30min時青?；【鶴67的發(fā)光強度。

1.2.4數(shù)據(jù)處理通常用相對發(fā)光強度反映毒性大小:毒性越大則對發(fā)光抑制越厲害，相對發(fā)光強度就越小，反之則發(fā)光強度越大。相對發(fā)光強度的計算公式為:相對發(fā)光強度=(樣品發(fā)光強度/對照發(fā)光強度)×100%根據(jù)擬合劑量－效應(yīng)曲線，計算甲醛與青?；【鶴67作用不同時間的半效應(yīng)濃度(EC50)，并以此判斷甲醛對青?；【鶴67毒性的大小。

2結(jié)果與討論

用超純水將甲醛標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋至6個質(zhì)量濃度(0，0.01，0.02，0.03，0.04和0.05g•L－1)，然后進行檢測。作用時間為5，10，15和30min時，不同質(zhì)量濃度的甲醛對青?；【鶴67的劑量－效應(yīng)擬合曲線見圖1。由圖1可以看出，隨著甲醛質(zhì)量濃度的升高，青?；【鶴67的相對發(fā)光強度逐漸降低，兩者成線性負相關(guān);隨著作用時間的延長，青?；【鶴67的相對發(fā)光強度逐漸降低，在15min時，線性方程為y=－1456.7x+97.814，相關(guān)系數(shù)R2=0.995，甲醛對青?；【鶴67的效應(yīng)擬合曲線線性較好，甲醛對青?；【鶴67的EC50為0.033g•L－1。甲醛對青?；【鶴67的最低檢測限為0.01g•L－1。使用發(fā)光細菌法檢測了8個化妝品(編號1—8)的甲醛毒性情況，結(jié)果見表1。由表1可知，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，在5～30min內(nèi)，用發(fā)光細菌檢測的8個化妝品中，3號，5號和8號樣品中的甲醛質(zhì)量分數(shù)分別為0.0022%，0.0015%和0.0028%，均低于0.2%，其余5個樣品均未檢出甲醛。6號加標(biāo)樣品15min時相對發(fā)光強度為70.86%，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出其甲醛質(zhì)量濃度為0.019g•L－1，加標(biāo)回收率約為95%。

分別采用發(fā)光細菌法(15min時相對發(fā)光強度下)和《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)中的甲醛檢測方法檢測化妝品中的甲醛含量，結(jié)果見表2。由表2可知，發(fā)光細菌法測定的甲醛含量同標(biāo)準(zhǔn)方法測得的甲醛含量基本一致。綜上，發(fā)光細菌法進行甲醛毒性的檢測，能直接、客觀地反映出甲醛對生物的急性毒性。對于人為添加原因造成的甲醛殘留，毒性測試可在15min內(nèi)快速現(xiàn)甲醛的毒性。由于化妝品成分復(fù)雜，干擾因素較多，在以后的實驗過程中，應(yīng)結(jié)合其他甲醛標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，進一步研究甲醛對發(fā)光細菌毒性的影響，同時根據(jù)不同的樣品，探索樣品前處理方法，使得甲醛毒性檢測盡量規(guī)避其他基質(zhì)的影響［6－7］。在分析前，還需對一些特定的檢測和一些特別的樣品進行測試前的準(zhǔn)備。

3結(jié)論

甲醛對青?；【鶴67的毒性存在顯著的劑量－效應(yīng)關(guān)系，且效應(yīng)能夠在短時間(15min左右)內(nèi)顯現(xiàn)并達到較佳效果，甲醛對青海弧菌Q67的EC50為0.033g•L－1。甲醛對青海弧菌Q67的最低檢測限為0.01g•L－1，所以發(fā)光細菌法可以用于快速檢測并判定其是否超標(biāo)。。

作者：張林張鵬鄒勇平周元元王磊傅芳芳趙渝單位：國家洗漱用品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心揚州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所上海師范大學(xué)