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1磁性納米材料的生物學修飾

磁性納米材料的生物學修飾是利用磁性納米材料分離富集致病菌的前提，將生物親和分子修飾到磁性納米材料的表面，賦予其捕獲目標菌的能力，間接地“磁化”細菌細胞（磁細菌），使磁細菌在外界磁場作用下能夠從樣品液中分離。另外，經修飾后的磁性納米材料可以獲得比單體生物分子更高的結合能力。例如，由于多個抗體分子可被修飾于磁性納米粒子上，磁性納米粒子經抗體修飾后，與目標菌的結合能力是單獨抗體的8倍；同理，經甘露糖修飾后，與目標菌的結合能力比單體甘露糖強200倍。磁性納米材料生物學修飾的方法有很多，大體分為直接修飾和間接修飾兩種。直接修飾又分為物理吸附和共價偶聯。物理吸附是指蛋白質等生物親和分子和納米材料間的疏水作用和靜電作用；共價偶聯是指先在納米材料的表面修飾硫化物、胺或者羧基，通過這些基團與生物親和分子形成共價鍵從而實現納米材料生物學修飾。間接修飾則需要利用一對具有強親和力的分子，比如生物素-親和素。先用親和素包被納米材料，再將要修飾的生物親和分子標記生物素，通過生物素和親和素的結合間接達到修飾磁性納米材料的目的。

2磁性納米材料捕獲致病菌的方式及其應用

磁性納米材料通過生物學修飾，獲得可以捕獲食源性致病菌的能力，再利用外界磁場從而達到分離菌體目的。表2總結了近幾年磁性納米材料在分離不同食品基質中食源性致病菌的研究。磁性納米材料表面使用的修飾物不同，捕獲食源性致病菌的方式也不同。

2.1抗原-抗體

基于抗原抗體之間的特異性反應實現食源性致病菌捕獲是最常用的方式，已被廣泛應用于各種食源性致病菌的分離富集。食源性致病菌相應的抗體也是磁性納米材料最常用的修飾物。將磁性納米材料的表面包被相應抗體，利用抗體和細菌表面相應抗原間的特異性結合，將食源性致病菌和磁性納米粒子連接，致病菌被“磁化”后，在外界磁場的作用下將目標菌從成份復雜的樣品液中分離出來，便于后續檢測。Varshney等通過生物素-鏈霉親和素將抗大腸桿菌抗體包被到磁性納米粒子的表面，用于捕獲牛肉樣本中大腸桿菌O157∶H7，捕獲效率達94.5%。Yang等用相應抗體修飾氧化鐵納米粒子，結合實時定量聚合酶鏈式反應，檢測牛奶樣品中的單增李斯特菌，檢測限達452CFU/mL。Ravindranath等分別制備了包被有抗大腸桿菌抗體和抗沙門氏菌抗體的功能化磁性納米粒子，用于分離雞尾酒和菠菜牛奶提取液中相應的食源性致病菌，結合紅外光譜分析，檢測限達104～105CFU/mL。Cheng等使用抗大腸桿菌O157∶H7抗體包被的磁性納米粒子分離牛奶中的大腸桿菌O157∶H7，結合三磷酸腺苷生物發光分析，檢測限達20CFU/mL。Wang等制備了兩種特異性抗體共修飾的磁性氧化鐵納米粒子用于同時分離菠菜中的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，結合表面增強拉曼散射分析，檢測限達103CFU/mL。

2.2黏附素（凝集素）-受體（糖類）

很多細菌會在其表面表達黏附素，它們能與宿主細胞表面相應受體結合，從而使細菌黏附在宿主細胞上。致病菌黏附宿主上皮細胞的機制與多種糖類有關。例如，大腸桿菌的表面可以表達產生多種黏附素，它們可以黏附宿主上皮細胞上的半乳糖、葡萄糖、果糖、巖藻糖、甘露糖和蔗糖等。利用黏附素與受體結合的性質，經凝集素或糖類修飾的磁性納米粒子可特異性地結合相應的食源性致病菌。EI-Boubbou等用D-甘露糖修飾的磁性納米粒子分離大腸桿菌，分離效率達88%以上。作者再結合X射線衍射、透射電鏡、熱重和紅外光譜分析，在5min內即可完成檢測，檢測限達104個菌體/mL。Payne等用凝集素修飾的BioMag®粒子分離食品基質中的致病菌，結果顯示，單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌最低分離起始濃度分別為大于等于10CFU/10g（卡蒙貝爾奶酪）、1CFU/10g（燉牛排）和小于10CFU/10g（生牛肉）。WangYixian等制備了基于凝集素的生物傳感器，用于分離檢測食品樣品中的大腸桿菌O157∶H7，檢測限達3×103CFU/mL。

2.3抗生素（萬古霉素）

萬古霉素是一種糖肽類抗生素，它可以與許多種革蘭氏陽性菌形成緊密的連接，其機制是通過細胞壁上的端肽D-Ala-D-Ala的氫鍵與萬古霉素聯接。一般認為，由于革蘭氏陰性菌外膜的存在，萬古霉素不能接觸到D-Ala-D-Ala端肽，因而不能識別革蘭氏陰性菌。據報道，經萬古霉素修飾過的磁性納米粒子同樣可以捕獲革蘭氏陰性菌，并由透射電子顯微鏡的照片猜想萬古霉素與革蘭氏陰性菌連接的機制為細菌外膜上存在缺陷區域，使部分D-Ala-D-Ala端肽暴露給萬古霉素。Kell等隨后驗證了這一猜想。Gu等在FePt磁性納米粒子表面修飾萬古霉素（FePt-Van），從大腸桿菌菌液中分離出菌體后再用透射電鏡觀察，檢測限達15CFU/mL。Kell等制備了萬古霉素修飾的磁性納米粒子用于同時分離水樣中革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌，結果顯示，不同的致病菌間捕獲效率相差很大（7%～88%）。Wan等使用萬古霉素修飾的磁性納米粒子分離磷酸鹽緩沖液中添加的海洋型硫還原型細菌（如，脫硫腸狀菌屬），結合生物傳感器，檢測限達1.8×104CFU/mL。Choi等在磁性氧化鐵納米粒子表面修飾萬古霉素，并用其對臨床樣本中的細菌進行分離，實驗結果發現，革蘭氏陽性菌的捕獲效率為（84.84±1.70）%，而革蘭氏陰性菌的捕獲效率為（48.48±1.79）%。Chen等用表面修飾有慶大霉素的磁性納米粒子用于分離磷酸鹽緩沖液中添加的金黃色葡萄球菌，最低分離的細菌濃度為0.5×103CFU/mL。

2.4DNA互補序列

任何細菌都有其特異性的基因片段，該基因片段的互補寡核苷酸片段可以識別樣品中的該種細菌。將寡核苷酸片段修飾后的磁性納米材料用于選擇性的分離目標DNA或RNA，再結合PCR鑒定，不僅省去樣品的預處理，靈敏度也比普通PCR提高近10倍。Amagliani等用與李斯特菌素O基因序列（hlyA）互補的寡核苷酸鏈修飾磁性氧化鐵納米粒子分離牛奶樣品中的單增李斯特菌的DNA，結合PCR分析，檢測限達10CFU/mL。筆者在2010年制備了分別針對單增李斯特菌和沙門氏菌的寡核苷酸修飾的磁性氧化鐵納米粒子用于分離魚中單增李斯特菌和沙門氏菌的DNA，結果發現，單增李斯特菌和沙門氏菌的捕獲效率分別為（62.5±10.0）%和（70.6±7.0）%。結合多重PCR分析，檢測限達1CFU/g。XuHongxia等研究了不同食源性致病菌寡核苷酸修飾的磁性納米粒子在致病菌分離中的應用，實驗結果發現，該磁性納米粒子可以快速富集相應致病菌（如，大腸桿菌O157、沙門氏菌等）。筆者進一步研究了同時使用食源性致病菌多個基因的互補寡核苷酸修飾的磁性納米粒子分離相應致病菌，結合傳感器檢測，檢測限達6×102CFU/mL。

2.5螯合反應

脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的重要組分，其中類脂A有大量的磷酸基團，用金屬氧化物（氧化鈦、氧化鋯或氧化鋁）包被磁性納米粒子，通過金屬氧化物與磷酸基團間的螯合反應，可與待測樣品中革蘭氏陰性菌形成復合物，在外界磁場的作用下可將食源性致病菌從成分復雜的待測液中非選擇性分離出來，消除樣品基質的干擾。Chen等在磁性氧化鐵納米粒子的表面包被二氧化鈦，利用脂多糖和金屬氧化物的螯合作用捕獲尿樣中的大腸桿菌、志賀氏菌和假單胞菌，磁分離富集菌體后經胰蛋白酶水解，再次磁分離除去磁性納米粒子，最后用基質輔助激光解吸-電離質譜法鑒定蛋白序列，根據蛋白庫中的信息確定細菌的種類。該方法是一種快速（耗時15min）、特異性強（可區分兩株不同的大腸桿菌）、靈敏（檢測限達104個細胞/mL）的分離檢測方法。2010年，筆者使用表面修飾有二氧化鈦的磁性氧化鐵納米粒子分離細菌混合液中的目標致病菌，隨后分離到的致病菌在紫外燈照射下結合二氧化鈦的滅菌作用，15min內可以抑制99.9%以上的目標菌的生長。

3結語

如何從復雜的食品樣品中高效特異地分離出數量極少的食源性致病菌，從而實現對目標菌高靈敏和高特異的檢測，一直是食品安全領域的一大瓶頸?，F今，磁性納米材料合成技術迅猛發展，以及其各方面性能的不斷完善，已被廣泛應用于食源性致病菌的分離富集。自從磁性納米材料應用于食源性致病菌分離以來，其快速（省去增菌培養的過程）、高效（捕獲效率高）和消除雜質干擾的能力均給人們帶來巨大驚喜。但在基于磁性納米材料的食源性致病菌分離方面，仍存在一些問題值得研究：1）盡管磁性納米材料捕獲食源性致病菌的方式很多，但是能夠實現高特異性捕獲的不多，尋找可與致病菌特異性結合的生物親和分子（如，適配體等）并將其應用于致病菌的磁分離值得探究；2）磁性納米材料對細菌潛在的毒性問題；3）就微米級磁性材料而言，納米級磁性材料分離食源性致病菌存在分離速度慢、磁場要求高的缺陷，怎樣通過生物反應放大系統（如，生物素-親和素系統）實現磁細菌信號的級聯放大，通過增大致病菌的磁性納米材料結合容量，在較低的磁場強度下就能實現磁細菌的分離并減少磁分離時間值得研究；4）目前常用的免疫磁分離方法大多屬于靜態分離方法，存在分離體積?。?～1.5mL）的缺陷，導致濃縮倍數低，從而造成磁富集效率不高，因此，探討大體積（如15、50mL）磁細菌快速分離具有重要的科學意義和實踐價值。

作者：黃小林許恒毅熊勇華曲鋒楊林單位：南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室