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1實驗部分

1.1菌種菌種為SphingomonaspaucimobilisNK2000（實驗室保藏）。

1.2培養基成分斜面培養基：蔗糖為3%，豆餅粉為0.6%，磷酸二氫鉀為0.14%，硫酸鎂為0.06%。種子培養基：蛋白胨為1%，牛肉膏為0.1%，葡萄糖為0.5%，氯化鈉為0.5%。發酵培養基：蔗糖為3%，豆餅粉為0.6%，磷酸二氫鉀為0.14%，硫酸鎂為0.06%。

2實驗步驟

2.1種子培養活化保藏在冰箱中的菌種，然后將斜面培養基在30±1℃的恒溫箱中培養24h。將種子培養基（100mL裝于500mL的錐形瓶中）在120℃下殺菌20min，冷卻，再用接種環從斜面上取一環放入消過毒的種子培養基中，于30±1℃的恒溫室中培養20h，搖床轉速為220rpm。

2.2發酵培養取90mL發酵培養基裝于500mL錐形瓶中，放入滅菌鍋中在120℃下滅菌20min，冷卻，取培養20h后的種子培養基10mL于發酵培養基中，于30±1℃的恒溫室中培養60h，搖床轉速為220rpm。

2.3黏度的測定溫度為25℃，取10mL濃度為15g/L結冷膠發酵液置于小燒杯中，使發酵液淹沒轉子末端，啟動轉子為4號的旋轉黏度儀，轉速50r/min，旋轉30s讀數記錄結果。

2.4產膠率的測定稱取發酵培養基的重量M，用2-3倍體積的95%乙醇洗滌兩次（加入酒精時應慢慢加入，快速攪拌，防止集聚在玻璃棒上的發酵液表面結冷膠萃取出來包裹住中間的發酵液，使萃取不完全），第二次洗滌后放在平穩的地方靜置20min，用紗布過濾，得到的粗膠在65℃干燥箱中干燥4h，取出后用天平稱量重量為m，產膠率為m/M。

2.5OD值的測定將發酵液稀釋適當的倍數，然后用紫外分光光度計測定發酵液的OD640值，根據所得結果適當稀釋發酵液濃度使所得OD640值在0.15～1.2之間。

2.6正交實驗根據單因素實驗選擇發酵培養基碳源（蔗糖）、氮源（豆餅粉）和無機鹽（硫酸鎂和磷酸二氫鉀）為正交試驗的4個因素，選擇3個合適的數值為水平設計正交試驗，正交試驗表采用L9（34），正交試驗的因素和水平如表1所示。每個樣品做三個平行樣，得出最佳的發酵條件。

3結果與分析

3.1菌種在種子培養基中的生長曲線實驗在波長為640nm的條件下進行，根據OD值確定菌種在種子培養基中的生長曲線，如圖1所示。根據生長曲線可以發現微生物在各個時間段的生長衰老情況［13］。由圖1可知：少動鞘脂單胞菌在種子培養基中的調整期大致為0～10h，對數期大致為10～22h，之后菌種生長基本等于衰老，菌種進入穩定期，這時次級代謝產物開始積累（即結冷膠開始大量積累）。

3.2發酵時間對產膠率的影響由圖1菌種在種子培養基中的生長曲線發現22h后菌種進入穩定期。圖2所示，24h時已有一部分結冷膠產生，并且發酵液黏度已經很高。隨著發酵時間的增加結冷膠不斷積累，黏度不斷的增高，在60h時發酵液的黏度和產膠率均達到最大值，分別為44744cp和1.4%。之后結冷膠產量和黏度均略微降低是因為菌種開始進入衰老期，有害物質積累過多，不適合菌種進一步生長和產膠。

3.3接種時間對產膠率的影響由圖1菌種的生長曲線可以大概確定菌種的對數期，即為最佳的接種時間，實驗將接種時間設定在14-26h，由圖3看出，當選擇接種時間為20h時結冷膠的黏度和產膠率都最高，和前邊得到的生長曲線相符合，所以最佳接種時間為20h。20h之前接種產量低是因為此時種子培養基中菌種還較少，接種后發酵培養基中菌種的調整期和對數期較長，延緩正常發酵；20h后接種產量也不高是因為這時種子培養基中有害物質已有一部分積累，不適合菌種生長，20h是菌種活力和有害物質積累的最好的臨界點。

3.4裝液量對產膠率的影響結冷膠的生產菌種少動鞘脂單胞菌是一種好氧細菌，發酵生產中氧氣的含量可以明顯的影響結冷膠的產量和黏度。適當的裝液量不僅可以有效的利用發酵空間，而且可以使發酵液更好的通氣和散熱，使菌種在最佳的氧氣環境中生長代謝，得到最佳發酵效果［14］。如圖4所示，隨著裝液量的增加，結冷膠產量和黏度都逐漸減少，裝液量小于20%時，隨著裝液量的增加結冷膠的產膠率和黏度變化較小；當裝液量大于20%時，隨著裝液量的增加結冷膠的產量和黏度減小較快。當裝液量為10%時，結冷膠的黏度和產膠率都最高，分別為45433cp和1.41%。

3.5接種量對產膠率的影響接種量是影響發酵的一個重要因素，如果接種量太少，菌種進入發酵培養基中會經過較長時間的調整期和對數期，延緩次級代謝產物的積累，不利于發酵效率的提高［15］；如果接種量過多，則會使發酵液中菌種生長繁殖過快，導致營養物質的大量消耗，同時從種子培養基中帶來較多代謝垃圾，不利于發酵的正常進行［16-17］，所以接種量的確定對發酵生產有重要的意義。如圖5所示，當接種量為10%時結冷膠的黏度和產膠率都最高，分別為44667cp和1.38%。當接種量超過14%時隨著接種量的增加，發酵效果明顯降低。

3.6發酵溫度對產膠率的影響如圖6所示，當溫度控制在30℃時結冷膠的黏度和產膠率都達到最大值，分別為45333cp和1.4%，發酵的最佳溫度為30℃。

3.7初始pH對產膠率的影響發酵液的pH是微生物是否能正常生長和繁殖的重要指標，它可以直接影響微生物細胞內部各種酶的活性強度，只有最佳的pH才能更好的促進細胞內各種反應的正常進行，從而促進少動鞘脂單胞菌次級代謝產物結冷膠的積累［14］。如圖7所示，當初始pH為7.2時結冷膠的黏度和產膠率都最高，分別為46000cp和1.41%。最佳初始pH為7.2。

3.8搖床轉速對產膠率的影響發酵生產中隨著結冷膠的不斷生成和積累發酵液的黏度不斷的增加，后期發酵液的黏度更是達到40000～50000cp，發酵液中菌種排出的有害氣體不能和搖瓶空氣中的氧氣對流就會很大程度的影響菌種的生長，所以搖床適當的旋轉很有必要，但是如果搖床轉速過快，剪切力過大就會破壞微生物細胞結構殺死一部分菌種，不適合菌種的正常生長和產膠［18］。如圖8所示，選擇合適的搖床轉速作為實驗變量，當轉速為220rpm時結冷膠的黏度和產膠率都最高，分別為46167cp和1.39%，搖床最佳轉速為220rpm。

3.9正交實驗結果分別以蔗糖、豆餅粉、硫酸鎂和磷酸二氫鉀作為正交試驗的4個因數，每種成分選擇3個不同添加量為3個水平做3水平4因數的正交試驗，如表2所示，影響結冷膠產膠率多少的順序為RA＞RC＞RB＞RD，所以發酵培養基的最佳配方為A2B3C2D2，即蔗糖為3%，豆餅粉為0.6%，硫酸鎂為0.06%，磷酸二氫鉀為0.14%。用最佳配方進行發酵培養，60h后測定的發酵液黏度和產膠率分別為44767cp和1.4%。

4結論

綜上所述，選擇四個對發酵影響較大的因素（溫度、pH、搖床轉速、接種量），確定三個水平進行正交試驗，得出影響發酵強弱的因素為：溫度＞pH＞搖床轉速＞接種量。最終得出發酵生產的最佳條件為：發酵時間為60h，接種時間為20h，裝液量為10%，發酵溫度控制在30℃，發酵液初始pH為7.2，搖床轉速為220rpm，接種量為10%，并且在這種條件下發酵結冷膠的黏度和產膠率分別為46867cp和1.41%。根據優化后的指標進行3次試驗，求得結冷膠黏度和產膠率平均值分別為46878cp和1.416%。可見，優化后的工藝參數值得借鑒。本研究為結冷膠的發酵生產擴大應用提供了有意義的基礎參數。

作者：陳強 劉鐘棟 白祥 裴延飛 單位：河南工業大學糧油食品學院 佳力士添加劑（海安）有限公司