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重組干酪乳桿菌是一種活載體口服疫苗候選菌株，并兼有乳酸菌的益生功能，而且在體內(nèi)能夠發(fā)揮許多生理效應(yīng)。傳統(tǒng)的干酪乳桿菌放大培養(yǎng)用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行，細(xì)菌數(shù)量和表達(dá)量較高，但MRS培養(yǎng)基的價(jià)格比較貴，成本較高，口感欠佳，所以人們將目光放在價(jià)格低廉，營養(yǎng)豐富，口感香甜的乳清蛋白上。乳清蛋白是從巴氏殺菌的乳清中去除非蛋白并經(jīng)過過濾沉淀制成的。乳清蛋白口感好，營養(yǎng)豐富，易消化吸收。將二者的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來以求研制出兼具預(yù)防和營養(yǎng)功能畜用口服液制劑。研究旨在將二者優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來以求研制出一種兼具預(yù)防和營養(yǎng)功能的畜用口服液制劑。試驗(yàn)選用乳清濃縮蛋白80為原料，研究其生產(chǎn)工藝最佳參數(shù)，制備有利于重組菌存活的液體制劑，為進(jìn)一步制備預(yù)防仔豬腹瀉口服液疫苗奠定基礎(chǔ)。

1材料

1.1質(zhì)粒和菌株TGEV-BC重組干酪乳桿菌有試驗(yàn)構(gòu)建并保存；干酪乳桿菌CICC6105（LactobacilluscaseiCICC6106）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2主要試劑瓊脂糖購買自Spanish公司產(chǎn)品；氯霉素購自Sigma公司；YeastExtract購自O(shè)XOID公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2方法

2.1口服液疫苗生產(chǎn)工藝流程菌種活化→菌種鑒定→轉(zhuǎn)接入乳清蛋白培養(yǎng)基→生產(chǎn)工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2重組菌的活化挑取培養(yǎng)好的MRS瓊脂平板上的單菌落，接入10mLMRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)16h，然后按2%接種量接入100mL的MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃靜止培養(yǎng)16h，備用。

2.3TGEV-BC重組干酪乳桿菌PCR的鑒定隨機(jī)挑取MRS培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于含氯霉素（34μg•mL-1）的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)過夜。按照DanielJ等提供的方法提取質(zhì)粒，方法如下：（1）取過夜培養(yǎng)的菌液2mL于離心管中，12000rpm離心1min收集菌體沉淀；（2）加入含有25%蔗糖和30mg•mL-1溶菌酶的溶液200μL重懸沉淀，混合均勻后，37℃水浴20min；（3）向溶液中加入含3%SDS和0.2N的NaOH的裂解液400μL，迅速混合均勻，室溫放置7min；（4）在向其中加入預(yù)冷的3M醋酸鈉300μL，4℃、12000rpm離心15min；（5）將上清液移到一個(gè)新的離心管中，加入650μL的異丙醇后，4℃、12000r•min-1離心15min；（6）棄去上清，加入1mL75%的乙醇洗滌沉淀，4℃、12000rpm離心5min，重復(fù)洗滌兩次；（7）傾倒上清，向其中加入30μL的含有Rnase酶的TE懸浮沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ锰崛『玫馁|(zhì)粒作為PCR模板進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)設(shè)置空菌作為對(duì)照組。用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2.4發(fā)酵生產(chǎn)工藝參數(shù)優(yōu)化

2.4.1乳清蛋白濃度對(duì)活菌數(shù)的影響將活化好的重組菌菌株，按2%的接種量分別接種于濃度為2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%的150mL乳清蛋白培養(yǎng)基中（起始pH7.0），厭氧條件下37℃靜止培養(yǎng)16h后分別取樣，涂平板計(jì)數(shù)。

2.4.2重組干酪乳桿菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)的影響將重組菌TGEV-BC/L.casei過夜培養(yǎng)，次日按2%接種于MRS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每2小時(shí)取樣一次，測(cè)其OD值，繪制乳酸菌的生長曲線。

2.4.3培養(yǎng)方式對(duì)重組菌活菌數(shù)影響的結(jié)果將活化好的菌株，采用間接接種方式按2%接種量分別接種于150mL濃度為2%的乳清蛋白培養(yǎng)基中（pH6.6）。因?yàn)槿樗峋菂捬跷⒑醚蹙圆捎靡韵?種培養(yǎng)方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即靜置培養(yǎng)、80r•min-1振蕩培養(yǎng)、100r•min-1振蕩培養(yǎng)、120r•min-1振蕩培養(yǎng)，厭氧條件下37℃培養(yǎng)16h后分別取樣，涂平板計(jì)數(shù)。

2.4.4半連續(xù)高密度探索采用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期的培養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基的方式，換液后培養(yǎng)1.5～2.0h，重復(fù)進(jìn)行3次操作，每次測(cè)定活菌數(shù)。

2.4.52L搖瓶放大培養(yǎng)采用優(yōu)化工藝參數(shù)，用2L搖瓶放大培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后取樣，檢測(cè)基因工程重組菌的表達(dá)情況并計(jì)算活菌數(shù)。

3結(jié)果

3.1TGEV-BC重組干酪乳桿菌PCR的鑒定的結(jié)果以TGEV-BC重組干酪乳桿菌為模板，通過設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)展，擴(kuò)展產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，可見1349bp的特異性條帶，與預(yù)期DN段大小一致。

3.2乳清蛋白濃度對(duì)重組菌活菌數(shù)的影響濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%乳清蛋白培養(yǎng)基對(duì)重組菌活菌數(shù)的影響見圖1，從圖中可知，隨著乳清蛋白濃度的增加，重組菌的活菌數(shù)也在隨之增加，但當(dāng)乳清蛋白濃度達(dá)到10%時(shí)，活菌數(shù)的數(shù)量達(dá)到最高。而后再進(jìn)一步提高乳清蛋白濃度，活菌數(shù)的數(shù)量不但沒有升高，反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這說明過高的濃度并不利于重組菌的生長。因此，確定乳清蛋白的最佳濃度為10%。

3.3重組干酪乳桿菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)的影響如圖3所示，酸菌延至期細(xì)菌代謝活躍，大量合成細(xì)胞分裂所需的酶類、ATP以及其他細(xì)胞成分。細(xì)胞往往不生長繁殖，其數(shù)目無明顯增加。為后面做準(zhǔn)備；乳酸菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長數(shù)期，細(xì)菌代謝旺盛，個(gè)體的形態(tài)和生理特性比較穩(wěn)定，開始迅速繁殖，進(jìn)入穩(wěn)定期后，有害代謝產(chǎn)物積累，新增細(xì)胞數(shù)目與死亡細(xì)胞數(shù)目達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，次級(jí)代謝產(chǎn)物大量積累，形成芽孢，細(xì)菌種內(nèi)斗爭最激烈，繁殖速率逐漸下降；進(jìn)入衰亡期，細(xì)菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)畸形細(xì)菌，營養(yǎng)耗盡，大量死亡。因此乳酸菌的最佳發(fā)酵時(shí)間為穩(wěn)定期的中后期，所以發(fā)酵時(shí)間為16h。

3.4培養(yǎng)方式對(duì)重組菌活菌數(shù)影響的結(jié)果隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速80r•min-1時(shí)，培養(yǎng)基中重組菌活菌數(shù)最高。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為120r•min-1時(shí)，培養(yǎng)基中重組菌活菌數(shù)略有下降低，氧氣的增加對(duì)重組菌的生長有抑制作用。因此，最佳的培養(yǎng)方式為采用80r•min-1震蕩培養(yǎng)，見圖4。

3.5半連續(xù)培養(yǎng)結(jié)果如圖5所示，乳酸菌發(fā)酵過程中，乳酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物大量積累，抑制乳酸菌的增值，補(bǔ)料后實(shí)現(xiàn)連續(xù)帶放、既可補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)又調(diào)節(jié)pH，使得發(fā)酵指數(shù)得以大幅度提高，與普通發(fā)酵相比，活菌數(shù)提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

3.6搖瓶培養(yǎng)的活菌數(shù)和基因表達(dá)結(jié)果采用優(yōu)化后的生產(chǎn)工藝參數(shù)，即乳清蛋白培養(yǎng)基的濃度為4%、發(fā)酵時(shí)間16h、轉(zhuǎn)速80r•min-1震蕩培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到重組菌活菌數(shù)的平均實(shí)測(cè)值為7.3×109cfu•mL-1。

4討論

基因工程菌是利用基因工程技術(shù)，將外源目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞使其表達(dá)所需蛋白的重組菌。基因工程菌發(fā)酵是為了獲得大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物，與發(fā)酵生產(chǎn)工藝的控制有非常重要的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)利用廉價(jià)乳清濃縮蛋白對(duì)TGEV-BC重組干酪乳桿菌口服液的生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究，通過單因素試驗(yàn)，研究了乳清蛋白濃度、乳酸菌發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)方式以及半連續(xù)培養(yǎng)對(duì)基因工程重組菌生長的影響。

基因工程菌的發(fā)酵是為了達(dá)到高密度培養(yǎng)，高密度培養(yǎng)需要高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)，才能保證菌體快速生長及大量表達(dá)目標(biāo)蛋白。但過高的濃度反而會(huì)抑制菌體生長和目標(biāo)蛋白的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)中，隨著乳清蛋白濃度的提高，重組干酪乳桿菌活菌數(shù)逐漸升高，在乳清蛋白濃度為10%的時(shí)候活菌數(shù)達(dá)到最高。當(dāng)乳清蛋白濃度超過這一范圍時(shí)，菌體的生長受到了抑制，數(shù)量開始下降，因此乳清蛋白濃度選擇10%為最佳培養(yǎng)濃度。乳酸菌發(fā)酵時(shí)間的控制是影響活菌數(shù)變化的重要因素。穩(wěn)定期時(shí)有害代謝產(chǎn)物積累，新增細(xì)胞數(shù)目與死亡細(xì)胞數(shù)目達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，次級(jí)代謝產(chǎn)物大量積累，形成芽孢，細(xì)菌種內(nèi)斗爭最激烈，活菌數(shù)達(dá)到最大值，穩(wěn)定期是以生產(chǎn)菌體為目的的發(fā)酵生產(chǎn)的最佳收獲期。因此最佳發(fā)酵時(shí)間為16h，此時(shí)活菌數(shù)最高。采用高密度發(fā)酵的工程菌，其溶氧濃度的高低也會(huì)影響培養(yǎng)基中的氧化還原電勢(shì)，從而使菌體的代謝途徑發(fā)生改變，影響菌體生長，進(jìn)而影響外源蛋白表達(dá)的產(chǎn)量。通過攪拌、震蕩方式可以控制溶解氧的濃度。在實(shí)驗(yàn)中，搖床轉(zhuǎn)速選擇為80r•min-1有利于菌體生長。

乳酸菌發(fā)酵過程中，不斷地消耗營養(yǎng)物質(zhì)，并產(chǎn)生大量乳酸，影響乳酸菌的生長；補(bǔ)料后，即可保證營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，又可緩解pH值下降，促進(jìn)乳酸菌的生長，提高活菌數(shù)。在基因工程菌的發(fā)酵過程中，要實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)及高目標(biāo)產(chǎn)物濃度還需要對(duì)工程菌發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行不斷地研究與改進(jìn)，只有科學(xué)系統(tǒng)地運(yùn)用發(fā)酵控制手段，才能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，更好地滿足市場(chǎng)需求。

作者：徐超 高寒 蘇小明 劉偉 劉衛(wèi)貞 余麗蕓 單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院