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《中山大學學報》2015年第五期

電離輻射以及某些化學誘變劑所誘導的dna雙鏈斷裂損傷(DNAdoublestrandbreak，DSB)是一種非常嚴重的DNA損傷。如果細胞不能對DNA雙鏈斷裂進行恰當的修復，通常會導致基因組突變或者細胞死亡。細胞中持續的DNA雙鏈斷裂損傷也會大大增加癌變的風險。所以，DNA雙鏈斷裂修復對維持基因組的穩定性起到了至關重要的作用。除了外源性因素所誘導的DNA雙鏈斷裂之外，內源性的因素也會導致DNA雙鏈斷裂損傷。約1%的單鏈DNA斷裂損傷(single-strandDNAle-sion，SSL)會轉變為雙鏈DNA損傷。同時，在同源染色體的重組過程中，DNA雙鏈斷裂損傷也有一定的幾率生成。有報道稱，在具有Bloom綜合征遺傳背景細胞中，一個細胞周期約有50個內源性DNA雙鏈斷裂產生，而正常細胞中內源性DSB水平相應降低。這相當于1.5～2Gy的電離輻射所誘導的DNA雙鏈斷裂。在腫瘤細胞中，內源性即本底水平的DNA雙鏈斷裂則更為顯著。在真核細胞中，DNA雙鏈斷裂的修復主要通過兩種方式:一種是同源重組(homologousrecom-bination，HR)，另一種是非同源末端連接(nonho-mologousendjoining，NHEJ)。譬如MRN復合物(由Mre11，Rad50和NBS1組成)、ATM(AtaxiaTelangiectasiaMutated)MDC1和BRCA1等相關蛋白都參與到雙鏈斷裂的修復過程中。對DSB損傷修復的動力學研究一直是重要的課題。同時，通過系統生物學方法對DSB修復進行的模型研究也不斷涌現。

早期的LPL(lethalandpotentiallylethal)模型以及RMR(repair-misrepair)模型是具有代表性的兩類模型。這些模型通過引入可能的一級和二級動力學修復過程，較好的解釋了輻射誘導的細胞死亡現象。但是，對于雙鏈斷裂損傷所引發的細胞死亡動力學，這兩類模型不能很好的進行擬合。基于進一步的實驗研究，Stewart提出了TLK模型(Two-LesionKineticModel)。在TLK模型中，根據DNA雙鏈斷裂產生的復雜程度，修復經歷了快修復和慢修復兩種過程。基于TLK模型的基本假設，Ma等利用MonteCarlo方法構建了一個抽象的數學模型，很好的模擬了DNA雙鏈斷裂損傷的動力學行為并因此成功的解釋了p53的數字脈沖現象。Ma等提出的模型被很多后續的研究者所借鑒，為進一步的解釋細胞命運決定機制起到了極大的推動作用。另外，其他的一些模型則通過引入具體的分子機制對DNA雙鏈斷裂損傷的修復進行了動態的研究。但是，以上的這些模型并沒有充分考慮到細胞周期和DNA雙鏈斷裂損傷產生及修復的聯系:即只考慮了電離輻射誘導產生的外源性DNA雙鏈斷裂的動態修復，而并沒有考慮內源性DNA雙鏈斷裂的動態變化。在輻射刺激下，細胞會發生細胞周期阻滯現象，并修復輻射誘導的DNA損傷。當DNA損傷降低到特定閾值以下，細胞周期將被重啟。細胞周期重啟后，細胞周期伴隨的內源性DNA雙鏈斷裂將不斷產生，并得到動態修復。所以，我們提出了一個改良的MonteCarlo模型，并綜合考慮了外源性和內源性DNA雙鏈斷裂損傷的動態修復過程，從而更真實的模擬了細胞在應激狀態下的DNA雙鏈斷裂損傷修復的動力學行為。

1材料與方法

1.1DNA雙鏈斷裂損傷概述DNA雙鏈損傷修復模型分為兩個模塊:分別為輻射誘導(外源性)DNA損傷修復和內源性DNA損傷修復模塊。兩個模塊都基于Stewart模型的基本假設，即根據損傷的復雜程度，DSB修復分為快修復和慢修復兩種動力學形態［7］。DNA修復過程通過MonteCarlo過程來模擬。

1.2外源性和內源性DSB數目初始化

1.2.1輻射誘導的DNA雙鏈斷裂修復根據文獻報道，1Gy的輻射劑量約產生30個DSB。為了充分考慮DSB生成的隨機化，根據Ma等的假設，我們設定DSB的生成服從Poisson分布，其參數λ=30•IR，這里IR為輻射劑量。根據Ma等的假設，70%的總DSB被快修復，而剩余的30%的DSB經歷慢修復過程。

1.2.2內源性DNA雙鏈斷裂修復假設內源性的DSB主要在細胞周期過程中產生。進一步限定，所有的DSB均在細胞周期中的S期和G2/M期產生，并服從均勻分布。為了簡化模型，對細胞周期的時長進行了限定，即長度為20h，其中G1，S和G2/M期的比例設為3∶4∶3。如文獻報道，乳腺癌腫瘤細胞MCF7的細胞周期約為20h，其中G1，S和G2/M期時長分別為6、8和6h，且周期不受外源輻射刺激影響。本模型關于細胞周期的時長以及內源性DSB發生時間的設定亦可設為它值(包括設置為隨機變量)，且不會對模型動力學產生定性的影響。在一個細胞周期中，我們設定將有50個DSB發生［3］。由于同源染色體重組等事件可誘發DSB，所以DSB產生主要處于S期。因此，假設其中40個產生于S期，剩余10個產生于G2/M期。在內源性DNA損傷修復模塊中，我們設定每一個生成的內源性DSB將有70%的概率被快修復，有30%的概率被慢修復。

1.3DSB修復的一般過程為了偶聯外源性和內源性DSB修復的過程，我們設定發生細胞周期阻滯(cellcyclearrest)的閾值為50個DSB。有文獻報道，正常細胞中當DSB水平小于20時，細胞周期阻滯將停止。但腫瘤細胞可以耐受更高水平的DNA損傷，所以我們將腫瘤細胞的閾值相應提高。當總DSB數目≤50時，細胞周期將被重啟。DSB的修復遵循如下過程。1.4DSB修復模型模擬工具隨機模擬通過MATLAB(MathWork，版本號7.12.0.635，R2011a)實現。

2結果

2.1DSB修復的動態變化通過運行MATLAB腳本程序，獲得了200組MonteCarlo模擬結果。圖2中對應的初始外源性輻射刺激為5Gy。具體為:產生200個隨機數，這些隨機數服從λ=150(5×30)的Poisson分布。接著將200個隨機數作為初始刺激水平。隨機數的產生運用到了MATLAB的庫函數poissrnd。產生的200組初始DSB分布可參見圖2A。圖2B示部分隨機DSB修復模型的模擬結果。發現DSB的修復在時間序列上呈現出很大的變異性，表現在每個細胞初始的DSB水平不同，這種變異是由所產生的200組符合Poisson分布的隨機數引起的。同時，細胞中DSB的修復速率也存在較大變異。當細胞重新進入細胞周期后，DSB的修復往往呈現一種非單調的動態變化(圖2B)。一些自發產生的內源性DNA損傷使得總體DSB數目經歷不同水平的瞬間上升。當自發DNA損傷產生較集中而修復能力相對較弱時，總體DSB水平會有更為顯著的升高(圖2B，左圖)。我們也注意到:在外源輻射施加24h后，細胞中仍然存在較高水平的DNA雙鏈損傷(圖2B)。即使將模擬時間延長到48h，這種動態行為仍然存在(圖2C)。我們分別統計了200組隨機模擬試驗中最低的DSB水平(注:時長為48h)。從柱狀圖中我們可以發現，所有的200組模擬結果都表明細胞中存在著未被修復的DNA損傷，同時在某些細胞中，DNA損傷可能一直維持在較高的水平(圖2C)。這些結果表明，細胞中DSB修復存在著較為顯著的變異，同時細胞也具有較高水平的本底DNA損傷。

2.2DSB修復過程中的變異性從圖2可知DSB修復的動態過程存在著較大的變異性。為了進一步描述這種變異行為，對200組時間序列進行描述性統計。結果顯示，DSB的修復存在著較為顯著的變異性(圖3A)。在DSB修復的初期，這種變異性較小，表現為較窄的置信區間。從平均水平上而言，DSB修復過程的半衰期(即令DSB水平下降到初值一半的時間)約為3.24h。而從約2h到10h這段時間內，DSB修復的變異相對較大(圖3A)。這種相對較顯著的變異可能是由早期外源性DNA的隨機修復引起的。與內源性DSB不同的是，外源DSB的發生服從Poisson分布，從而在隨機修復的基礎上引入了額外的不確定性。隨著時間的推移，隨機修復合并初值隨機分布的變異將愈發顯著，進而可能導致DSB的修復在半衰期附近存在較大變異。當較多的外源性DSB得到了修復后，總DSB接近于重新觸發細胞周期的水平。由于未被修復的DSB水平較之初始狀態顯著降低，所以隨機修復的變異也隨之下降。進一步統計了200組模擬的半衰期。結果顯示，DSB的半衰期亦存在著較為明顯的變異(圖3B)。同時，半衰期的分布與時間序列中變異較為顯著的區域也具有一定的吻合。以上結果暗示，DSB的損傷修復具有較為顯著的變異性。

3討論

本文提出了一個更為精細化的DNA雙鏈斷裂損傷修復模型。在這個模型中，考慮了外源性和內源性DSB在修復過程中的偶聯，并對此模型進行了MonteCarlo模擬。模擬結果顯示，DSB的修復具有顯著的變異性(圖2、圖3)。同時，由于本底水平即內源性DNA損傷的隨機發生，DSB的動態變化并非呈現一種單調降低的行為(圖2B)。這種非單調的行為是以往的模型所忽視的。最近Loe-wer等的實驗顯示腫瘤細胞中的DNA雙鏈損傷可能呈現非單調的動態行為，從而為本文模擬結果提供了依據。所以，本文模型可以較好的模擬細胞完整生命周期中的DSB損傷修復行為。值得注意的是Ma等之前的模型并沒有考慮具體的DSB修復信號轉導網絡，轉而根據TLK的基本假設提出了一個較為抽象的模型。其優勢在于DSB修復的信號轉導網絡仍存在較大的未知，且已知參與修復的蛋白復合物相互作用較為復雜。

若采用常規的常微分方程建模方法，將極大的增加模型的復雜程度。運用抽象的MonteCarlo模擬方法既能較好的模擬DSB修復的隨機動力學行為，同時又能巧妙的回避具體信號轉導網絡的未知因素。所以，本文基于Ma等的模型，提出了DSB修復的更為完整的模型，即同時考慮內源性和外源性DSB損傷的修復過程及其偶聯效應，更好的描述了細胞在應激狀態下的DSB修復過程。需要注意的是，本模型參數主要基于腫瘤細胞相關研究進行的估計，所以此模型旨在描述非正常細胞的DSB修復行為［18］。對于正常的細胞而言，本底水平的DSB數量較之腫瘤細胞顯著的降低，同時觸發細胞周期阻滯的DSB閾值也較低。同時，腫瘤細胞中的基因突變很可能導致正確修復速率的顯著降低。綜合以上的因素，正常細胞中的DSB修復可能具有更高的效率，從而使得正常細胞中的DSB修復動力學性質可能會與腫瘤細胞中的相關性質具有一定的差異。通過改變模型參數(如增大kfix1或減少內源性DSB總量)，即可對正常細胞的DSB修復進行定性的模擬。所以，本模型具有一定的普適性。

提出較為完整的DSB修復模型對于其它信號轉導網絡的相關動力學行為研究也具有很大的必要性。譬如ATM可以作為感受器感知DSB的變化，并得到活化。活化的ATM可以作為激酶磷酸化p53蛋白并借此與復雜的p53信號轉導網絡建立直接的聯系。P53在未受刺激和應激狀態下(如電離輻射和紫外線)都表現出復雜的動力學行為。以往描述p53動力學模型中的DNA損傷修復模塊都沒有很好的考慮外源性和內源性DNA損傷的協同作用，所以不能很好的同時解釋p53在受迫和未受迫狀態下的動力學行為。所以，本模型可能有助于其它信號轉導網絡的動力學行為研究。譬如內源性的DNA損傷會在非受迫狀態下觸發p53的自發脈沖，那么就為研究p53的本底動力學和p53單細胞動力學中存在的線性現象提供了可能。此外，DSB修復模型與細胞周期信號轉導網絡的偶聯也可能有助于模擬更為真實的細胞周期中的動力學現象［26］。DNA損傷修復與特定信號轉導網絡的相互作用也可能產生反饋或前饋作用，從而產生更為復雜的動力學行為。隨著對DNA雙鏈斷裂損傷修復過程認識的不斷深入，建立更為精細化的基于具體分子機制的DNA損傷修復模型并結合恰當的隨機模擬方法將有助于實現對損傷修復過程更為精確的定量研究。

作者：孫廷哲 崔雋 單位：安慶師范學院生命科學學院 基因工程教育部重點實驗室 中山大學生命科學學院