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《工業微生物雜志》2016年第5期

摘要:

白藜蘆醇是一種具有較強抗氧化和防癌、抗癌等生理活性的植物天然產物，其功能與生產是當前的研究熱點;然而，白藜蘆醇的光穩定性和熱穩定性較差。在微生物發酵生產及存儲過程中需要采取特殊的工藝，以防止其降解，使得發酵及存儲工藝復雜化，增加了成本。本研究對發酵及存儲過程中的各類條件，如溫度、pH、培養基成分及大腸桿菌對白藜蘆醇的降解情況進行了初步的研究;使用液相色譜-離子阱-飛行時間質譜，對白藜蘆醇的降解產物進行了分析。本研究可作為基礎資料，為降低發酵生產及存儲過程中白藜蘆醇的降解提供重要參考。

關鍵詞:

白藜蘆醇;降解;液相色譜-離子阱-飛行時間質譜;白藜蘆醇二聚體

白藜蘆醇是植物界分布較廣的羥基二苯乙烯類多酚化合物，來源于花生、葡萄、虎杖和桑葚等植物，是一種植物抗毒素，對革蘭氏陽性細菌的生長有一定抑制作用，具有抗炎、抗心血管疾病等多種生理活性［1，2］。同時，白藜蘆醇也具有較強的抗氧化［3］和防癌抗癌［4］的生理活性，可作為腫瘤的化學預防劑，亦可降低和防治動脈粥樣硬化心血管疾病。白藜蘆醇有反式和順式兩種異構體，生理活性方面反式強于順式。近年來，白藜蘆醇的功能和生產成了研究的熱點［5］。目前市場上的白藜蘆醇多來源于植物提取法，由于其在植物中含量較低，導致其生產成本較高，無法滿足日益增長的市場需求。因此，采用合成生物學方法改造微生物合成白藜蘆醇成為一個重要的選擇［6］。已有多篇文獻報道利用大腸桿菌、釀酒酵母等微生物異源合成白藜蘆醇［7，8］。已有的研究表明，白藜蘆醇在水溶液中的光穩定性和熱穩定性均較差［9］。白藜蘆醇的合成過程中需要消耗大量的能量，需要在好氧的水相體系中進行。這使得白藜蘆醇在水溶液中的積累和其合成產生了不可避免的矛盾［10］，增加了白藜蘆醇高效發酵生產的過程的復雜性，導致生產過程中必須采取嚴格優化的發酵條件及培養基，以盡量減少白藜蘆醇的損失［11］。本研究對白藜蘆醇在不同溫度、pH及培養基成分中降解速率進行了初步研究，并考察了大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響。進一步通過液相色譜-離子阱-飛行時間質譜聯用，分析了白藜蘆醇降解的主要產物。本研究結果有助于理解微生物異源發酵生產白藜蘆醇過程中各種環境因子對白藜蘆醇降解的影響，對強化發酵過程中目標產物的積累具有重要的參考價值。此外，相關結果也將對減少食品加工和貯存過程中白藜蘆醇的降解程度提供必要的依據。

1材料與方法

1．1菌種

大腸桿菌BL21(DE3)，用于考察大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響。

1．2儀器與試劑

白藜蘆醇標樣購自Sigma-Aldrich公司，蛋白胨、酵母提取物購自Oxoid公司，M9培養基購自生工生物工程(上海)股份有限公司，甲醇和乙腈(色譜純)購自MerckKGaA公司，流動相所用超純水由Milli-QUF-Plus超純水系統制備所得(電阻率＞18MΩ•cm)。其他常規試劑為國產分析純。UFLC購自日本Shimadzu公司，配備一臺LC-20AD二元泵、一臺SIL-20AC自動進樣器以及一臺CTO-20AC柱溫箱。質譜設備采用日本Shimadzu公司的離子阱-飛行時間質譜，采用電噴霧離子源(ESI)。

1．3培養基及樣品制備

LB培養基:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl。M9培養基:10×M9鹽200mL，1mol/L硫酸鎂2mL，1mol/L氯化鈣100μL，以無菌水定容至1L。10×M9鹽:64g磷酸氫二鈉，15g磷酸二氫鉀，2．5g氯化鈉，5．0g氯化銨，以去離子水定容至1L后滅菌。10×M9鹽、硫酸鎂和氯化鈣分別滅菌后混合，防止沉淀。蛋白胨水溶液:10g/L蛋白胨。酵母粉水溶液:5g/L酵母提取物。白藜蘆醇儲備液:精確稱量10mg白藜蘆醇標準品，以乙醇溶解并定容于10mL容量瓶中，獲得質量濃度為1g/L的儲備液，于－20℃下避光保存。由于白藜蘆醇的光穩定性極差，所有本實驗中的白藜蘆醇溶液均儲存于鋁箔包裹的離心管中，實驗中全程避光。

1．4溫度及pH對白藜蘆醇降解的影響

用PBS緩沖液(pH7．4)將白藜蘆醇儲備液稀釋至50mg/L，分裝至鋁箔包裹的14mL培養管中，分別放置于25℃、30℃、37℃和42℃條件下，用于檢測溫度對白藜蘆醇降解的影響。用pH分別為3．0、5．0、7．0、9．0和11．0的緩沖液，將白藜蘆醇儲備液稀釋至50μg/mL，分裝至鋁箔包裹的14mL培養管中，放置于25℃條件下，用于檢測pH對白藜蘆醇降解的影響。所有的樣品取出后立即12000r/min離心1min，經過0．2μm濾膜過濾后用于LCMS-IT-TOF檢測，取樣時間點為2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h和72h。

1．5不同培養基對白藜蘆醇降解的影響

分別用水、蛋白胨水溶液、酵母提取物水溶液、LB培養基和M9培養基將白藜蘆醇儲備液稀釋至50μg/mL，分裝至鋁箔包裹的14mL培養管中，放置于30℃培養箱中，用于檢測不同培養基對白藜蘆醇降解的影響。將一株大腸桿菌BL21(DE3)接種至LB培養基，于37℃、200r/min培養至OD600=0．6時，轉接至含有50μg/mL白藜蘆醇的LB培養基中，于30℃，200r/min繼續培養48h，用于檢測大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響。所有的樣品取出后都立即12000r/min離心1min，經過0．2μm濾膜過濾后用于LCMS-IT-TOF檢測，取樣時間點為2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h和72h。

1．6降解動力學參數的計算

溫度對白藜蘆醇降解速率影響的參數利用阿累尼烏斯方程計算:lnk=lnA－EaRT其中A為指前因子，Ea為活化能(J/mol)，R為摩爾氣體常量(8．314J/kmol)，T為絕對溫度。

1．7LCMS-IT-TOF分析

樣品采用ShimazuVP-ODSC18柱(2mmi．d．250mm，5mm)進行色譜分離［12］，進樣量為5μL，流動相為0．1%的乙酸(30%，A)和乙腈(70%，B)，柱溫為35℃，流速為0．2mL/min，進入質譜的分流比為100%。TOF檢測使用ESI離子源，檢測模式為負離子模式，檢測電壓1．56kV，霧化氣(N2)流速1．5L/min，干燥氣(N2)壓力100kPa;離子收集時間30ms;碰撞能量50%，MS1掃描范圍(100～600)m/z，MS2掃描范圍(100～500)m/z。

2結果與討論

2．1溫度對白藜蘆醇降解的影響

不同溫度(25℃、30℃、37℃和42℃)下白藜蘆醇的降解過程如圖1所示。pH7．0時，白藜蘆醇在37℃和42℃迅速的降解，在25℃時降解速度稍有減慢。不同溫度下計算所得的白藜蘆醇降解動力學參數如表1所示。白藜蘆醇在pH7．0時不同溫度下的降解過程符合一級動力學方程，溫度對白藜蘆醇降解速率的影響遵循阿累尼烏斯方程:logkobs=24．896－9360．8(1/T)(r2=0．99)。白藜蘆醇降解速率對溫度敏感的原因在于其活化能位于50～96kJ/mol范圍內［13］。由上述結果可以看出，溫度上升能明顯加快白藜蘆醇的降解速率，因此在生理溫度下進行的白藜蘆醇研究(白藜蘆醇的生理活性以及胞內藥物傳遞，白藜蘆醇的微生物合成等)都需要注意白藜蘆醇的高降解速率。有些研究時間長達48h［14］甚至72h［15］，在此過程中，超過一半的白藜蘆醇可能會被降解，從而影響實驗結果。

2．2pH對白藜蘆醇降解的影響

白藜蘆醇在不同pH條件(3．0、5．0、7．0、9．0和11．0)下的降解過程如圖2所示。白藜蘆醇在酸性條件下相對穩定，然而在堿性條件下卻快速降解。白藜蘆醇在酸性條件下穩定是由于其羥基被大量帶正電荷的H3O+所保護［16］。當pH高于7．0時，白藜蘆醇的降解速度顯著加快;當pH高于9．0時，白藜蘆醇能在數分鐘內以肉眼可見的速度被降解，溶液顏色迅速加深。在pH9．0時，白藜蘆醇的一個羥基部分去質子化;而當pH達到10．0時，白藜蘆醇的一個羥基完全去質子化而另一個羥基也部分去質子化［17］。這表明白藜蘆醇堿降解的機制可能與其羥基解離的程度有關。然而，目前大部分圍繞白藜蘆醇的實驗都是在pH7．0左右的環境里進行的，因此不可避免的會受到白藜蘆醇降解的影響。

2．3不同的培養基成分對白藜蘆醇降解的影響

白藜蘆醇在不同培養基(水、蛋白胨水溶液、酵母提取物水溶液、LB培養基和M9培養基)中的降解過程如圖3。在本研究中，白藜蘆醇的降解速率都一定程度的受到溫度和pH的影響，因為培養基都是在適合菌體生長的溫度和pH條件下放置，很少會有需要在低溫和pH較低的條件下進行實驗的培養基。由結果可以看出，M9培養基對白藜蘆醇降解的影響最小，在經過72h之后仍有超過70%的白藜蘆醇未被降解;酵母提取物對白藜蘆醇的降解有一定的影響，72h時白藜蘆醇含量相比水中的多降解了23%;而在含有蛋白胨的水溶液以及含有蛋白胨的LB培養基中，白藜蘆醇降解速率明顯加快，經過72h后幾乎沒有白藜蘆醇殘留，全部被降解。由此可見，培養基中的蛋白胨成分會較明顯的促進白藜蘆醇的降解。由于許多豐富培養基中都含有蛋白胨成分，因此當使用這些培養基培養微生物進行白藜蘆醇發酵生產時，會受到白藜蘆醇降解的影響，從而影響產量。

2．4大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響

大腸桿菌對白藜蘆醇降解的影響如圖4所示。在添加大腸桿菌BL21(DE3)的LB培養基中，在前24h白藜蘆醇的降解速率稍有加快;24h之后，白藜蘆醇的降解速率開始減慢;到72h時，未添加大腸桿菌BL21(DE3)的LB培養基中白藜蘆醇已經完全降解，而添加大腸桿菌BL21(DE3)的LB培養基中還有10%白藜蘆醇殘留。該現象可能的原因是發酵過程中pH的降低，減慢了白藜蘆醇的降解;培養基中的蛋白胨被大腸桿菌消耗，減少了蛋白胨的含量。由此可知，大腸桿菌的生長對白藜蘆醇的降解并沒有顯著的影響，利用代謝工程改造的大腸桿菌生產白藜蘆醇不會增加白藜蘆醇的降解。

2．5LCMS-IT-TOF分析降解產物

白藜蘆醇主要降解產物的分析通過LCMS-IT-TOF來完成。利用全掃描模式對白藜蘆醇的降解產物進行分析之后，得到主要的降解產物的質譜圖，見圖5。結果表明，白藜蘆醇降解的主要產物有兩個，即m/z453．1683和m/z243．0636。為了得到這兩種物質可能的結構，將m/z453．1683和m/z243．0636作為母離子，進一步打碎檢測二級質譜，得到的二級質譜圖如圖6和圖7。由二級質譜結果可知，m/z453．1683和m/z243．0636打碎之后都得到了一個碎片峰m/z227，為白藜蘆醇的［M-1］－峰。m/z453．1683對應［2M-2H-1］－，來源于兩分子白藜蘆醇脫去兩個氫結合成的白藜蘆醇二聚體;而m/z243．0636對應［M+O-1］－，是白藜蘆醇被氧化得到的產物氧化白藜蘆醇(2，3'，4，5'-四羥基二苯乙烯)。將二級質譜結果導入MZmine-2．10進行處理，處理結果與KEGGCompound數據庫進行比對，結果表明，加入大腸桿菌和白藜蘆醇的培養基中甲基胞嘧啶含量有較大程度的增加，這可能與白藜蘆醇多聚物抑制細菌DNA合成有關［18］。其他降解產物在總離子流圖(TIC)上出峰較小，無法逐一進行分析。

3結論

通過研究不同溫度、pH和培養基成分等環境因子對白藜蘆醇降解的影響，本研究發現，較高的溫度、pH，以及培養基中蛋白胨的存在，均會導致白藜蘆醇降解速率的加快;而在低溫、酸性及不含蛋白胨的條件下白藜蘆醇穩定性較高。該發現有助于降低發酵過程中白藜蘆醇的降解速率，同時可作為白藜蘆醇長期保存的重要參考。通過對白藜蘆醇的降解產物進行分析，得到了其中兩個主要的降解產物，即白藜蘆醇二聚體和氧化白藜蘆醇。此外，通過在培養基中添加大腸桿菌BL21(DE3)發現，大腸桿菌的生長不會增加白藜蘆醇的降解速率，證明了利用代謝工程改造大腸桿菌生產白藜蘆醇的可行性。

參考文獻：

［2］于貞，張影陸，趙光鰲．葡萄酒中白藜蘆醇的分析．工業微生物，2001，31(4):34-36．

［12］戴群，趙光鰲．HPLC測定葡萄中活性物質———白藜蘆醇的含量．工業微生物，1999，29(3):22-24．

作者:朱屹東 周景文 堵國成 單位:江南大學生物工程學院