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摘要：描述了現(xiàn)在濕地微生物活性的研究狀況、環(huán)境因子對(duì)微生物群落多樣性產(chǎn)生的影響、濕地環(huán)境下功能性微生物的探究情況。重點(diǎn)就目前應(yīng)用比較多的測(cè)定微生物多樣性的研究方法如傳統(tǒng)培養(yǎng)法、磷脂脂肪酸法、高通量測(cè)序技術(shù)等作出細(xì)致描述并針對(duì)各種研究方法的優(yōu)勢(shì)及劣勢(shì)進(jìn)行了比對(duì)分析。根據(jù)當(dāng)前微生物數(shù)量和多樣性的檢查方式，在以后的分析過(guò)程中引進(jìn)更優(yōu)良的技術(shù)同時(shí)找到新的研究方法，以此來(lái)發(fā)現(xiàn)微生物種群很多未知的領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：濕地；微生物多樣性；分子生物學(xué)；環(huán)境因子

濕地兼具水生生態(tài)系統(tǒng)和陸地生態(tài)系統(tǒng)的特性，能調(diào)節(jié)局部區(qū)域氣候和維持群落微生物多樣性[1]。微生物多樣性包括微生物遺傳的多樣性，還包含了群落組成的變異、營(yíng)養(yǎng)需求和供給水平、互相影響的復(fù)雜性以及共位群帶來(lái)的生物復(fù)雜性[2]。濕地微生物的研究有助于人們了解濕地微生物與其他因子間是否存在協(xié)同作用，從而構(gòu)建更高效穩(wěn)定的濕地系統(tǒng)。

1濕地微生物群落的研究方法

1.1傳統(tǒng)培養(yǎng)法培養(yǎng)法一般采用的培養(yǎng)基內(nèi)所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同，針對(duì)能夠在培養(yǎng)基環(huán)境下生長(zhǎng)的微生物進(jìn)行研究。這種方式主要針對(duì)具有一種作用的微生物或某種病原菌的研究。但培養(yǎng)法的局限在于無(wú)法探明微生物的整體群落結(jié)構(gòu)，且目前技術(shù)可培養(yǎng)微生物種類尚且不足微生物總體的百分之一。

1.2微生物群落生理代謝的研究方法1.2.1磷脂脂肪酸技術(shù)磷脂幾乎是所有具有活性細(xì)胞細(xì)胞膜的組成要素，一般伴著細(xì)胞凋亡逐漸脫落分解[3]。磷脂脂肪酸技術(shù)利用有機(jī)溶劑將活體微生物中的磷脂脂肪酸浸提出來(lái)經(jīng)分離純化后，對(duì)磷脂脂肪酸圖譜進(jìn)行解析從而了解微生物群落結(jié)構(gòu)以及生物量[4]。在2001年，DuongruitaiNicomrat借助PLFA分析在廢棄礦山中濕地微生物的種類，結(jié)果顯示真菌和細(xì)菌是濕地系統(tǒng)中的主要種類，古細(xì)菌所占的相對(duì)豐度尚未到總微生物整體的0.01%[5]。該技術(shù)適用于批量分析，能夠反映出濕地污染狀況的改變。但目前還無(wú)法通過(guò)PLFA技術(shù)對(duì)微生物類群精準(zhǔn)鑒定到種，并且土壤中有植物殘?bào)w存在，其中的磷脂脂肪酸會(huì)產(chǎn)生干擾。因此將PLFA技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合，會(huì)對(duì)濕地微生物群落的多樣性有更加全面的認(rèn)識(shí)。1.2.2BIOLOG碳素利用法BIOLOG碳素利用法是基于不同微生物利用碳源能力的區(qū)別以及代謝差異。該方法具有靈敏度高分辨力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠盡可能保證微生物可以通過(guò)以往的代謝方式進(jìn)行生產(chǎn)，這種形式通常適用于評(píng)估土壤環(huán)境功能及微生物的群落結(jié)構(gòu)。但是該方法使用中也存在著底物是否氧化完全等問(wèn)題

1.3分子生物學(xué)方法1.3.1熒光原位雜交技術(shù)（FISH）FISH方法主要借助寡核苷酸探針再結(jié)合核酸，通過(guò)特殊的熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)所要尋找的DNA或RNA分子[6]。FISH方法現(xiàn)在主要是在特定環(huán)境條件下辨別微生物類群和定量檢查種群密度，描述水平細(xì)致的條件符合當(dāng)前要求。熒光原位雜交技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于不需要選擇核酸，還能確保微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和狀態(tài)能保證基本完整[7]。但該技術(shù)易受探針長(zhǎng)度、雜交溫度和時(shí)間等因素的影響。1.3.2變性梯度凝膠電泳(DGGE)DGGE的原理是當(dāng)達(dá)到DNA雙螺旋分離所需溫度的最小值時(shí)，雙鏈DNA會(huì)出現(xiàn)分解現(xiàn)象，最后形成的單鏈DNA無(wú)法在凝膠中順暢運(yùn)行，同時(shí)螺旋位置分離是根據(jù)雙鏈基因的堿基序列進(jìn)行執(zhí)行的。因此觀察DGGE指紋圖譜的條帶數(shù)目可以發(fā)現(xiàn)各種樣品細(xì)菌群落所具有的相同一面。然而在進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳時(shí)會(huì)導(dǎo)致共性遷移現(xiàn)象出現(xiàn)，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定的影響[8]。在2003年，Ibekwe通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)針對(duì)氨單加氧酶基因(amoA)擴(kuò)增條以及16SrRNA基因和帶都分別進(jìn)行研究，分析濕地環(huán)境下細(xì)菌種群的總數(shù)目以及氨氧化后的細(xì)菌種群出現(xiàn)了哪些改變[9]。1.3.3熒光定量PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR技術(shù)，是上世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特異性DN段的技術(shù)。Ochsenreite等研究了18處陸地環(huán)境中泉古菌的多樣性和豐度，利用qPCR確定了泉古菌在沙地根際和土壤中的相對(duì)豐度[10]。qPCR精確性高、特異性強(qiáng)且后期操作簡(jiǎn)單，同時(shí)可從基因水平對(duì)微生物功能基因定量分析，特別是對(duì)氮循環(huán)相關(guān)功能菌群定量分析[11]。其優(yōu)點(diǎn)在于可以在一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行一個(gè)以上基因的定量檢測(cè)。但其反應(yīng)成本過(guò)高，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較為復(fù)雜。1.3.4高通量測(cè)序技術(shù)由于近些年來(lái)很多學(xué)者利用變性梯度凝膠電泳和熒光定量PCR等技術(shù)分析濕地微生物種類，然而該形式對(duì)微生物品種無(wú)法實(shí)現(xiàn)定性和定量研究同時(shí)進(jìn)行。HelicoBioScience企業(yè)2008在Science雜志發(fā)表了其研發(fā)的在全內(nèi)反射顯微鏡的測(cè)序技術(shù)-單分子測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上，總共發(fā)現(xiàn)了28萬(wàn)條序列信息，打開(kāi)了在單分子且通量高的情況下進(jìn)行測(cè)量序列的大門(mén)。然而在通量高情況下檢測(cè)的堿基序列如何去解讀，也是科研工作者面臨的科學(xué)問(wèn)題。

2展望

濕地環(huán)境中的微生物對(duì)維持濕地體系的基本運(yùn)作以及構(gòu)造都發(fā)揮至關(guān)重要的功能。現(xiàn)在針對(duì)功能性微生物的調(diào)查和分析存在欠缺，在濕地環(huán)境中，菌落的功能性是整個(gè)濕地系統(tǒng)運(yùn)行的關(guān)鍵，所以研發(fā)借助功能基因主導(dǎo)的各種分子技術(shù)手段進(jìn)行探索各種濕地環(huán)境中微生物種群的功能特征和差異，辨別和掌握微生物給濕地系統(tǒng)帶來(lái)的去污效果，有利于將來(lái)對(duì)濕地進(jìn)行開(kāi)發(fā)、利用等方面工作的順利開(kāi)展。

參考文獻(xiàn)： 

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［8］高淑靜，吳鳳芝.PCR-DGGE技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J].生物信息學(xué)，2008，55(4):174-175.

作者：趙思宇 馬信 陳星宇 王欣鈺 孫長(zhǎng)龍 張陽(yáng) 單位： 沈陽(yáng)師范大學(xué)