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《江西農業大學學報》2016年第一期

摘要:

為研究江西不同土壤條件下煙葉類胡蘿卜素代謝的差異，在江西省撫州廣昌煙區典型的旱地紫色土和水田砂壤土條件下，對煙草(NicotianatabacumcLcv．K326)葉片類胡蘿卜素積累規律、類胡蘿卜素代謝關鍵酶基因的表達規律進行了比較研究。RT-PCR分析表明，類胡蘿卜素合成相關基因(PSY、PDS、LCYb、ZEP)及降解相關基因(CCD1)轉錄水平的表達在水田沙壤土煙葉中更為活躍;但LC/MS檢測結果顯示，旱地紫色土煙葉中類胡蘿卜素積累水平較高，尤其是在煙葉成熟后期，β-胡蘿卜素、葉黃素、新黃質等含量明顯高于水田沙壤土煙葉。雖然烤后煙葉中，旱地紫色土和水田砂壤土煙葉類胡蘿卜素降解產物總量相近，但巨豆三烯酮、二氫大馬酮、香葉基丙酮等物質在旱地紫色土煙葉中含量較高，這可能是形成紫色土煙葉風格特征的主要因素之一。

關鍵詞:

土壤;煙葉;類胡蘿卜素;代謝;比較

煙葉的質量和風格特色受到煙草品種特性、栽培措施及生態環境等多種因素的綜合影響［1］，其中，土壤作為煙株賴以生存的基本條件，與煙葉生長發育和物質代謝密切相關，是決定煙葉特色風格的關鍵因素之一。逄濤等［2］對云南煙區不同土壤類型K326煙葉化學成分進行了的比較研究，發現總糖、還原糖等多個指標在不同土壤類型間存在顯著差異。陳杰等［3］對貴州不同質地烤煙的質量分析表明，砂壤土種植的煙葉具有高糖、低堿、高糖堿比和高氮堿比的特征;粉黏土具有低糖，高堿，低糖堿比和低氮堿比的特征。已有的研究證明，土壤類型對烤后煙葉的質量風格影響顯著，但關于土壤影響煙葉質量風格的機制仍不清楚，尤其是對不同土壤條件下煙葉類胡蘿卜素代謝特征缺乏研究。江西土壤類型多樣。其中，旱地紫色土和水田砂壤土是植煙土壤的典型代表。紫色土以酸性和中性土壤為主，通氣性好，質地上輕下重，有較強的保水保肥性能，鉀含量較高，氮和有機質的含量較低［4］;水田砂壤土:砂壤土質地偏輕，土壤的通透性較好，具有較高的基礎肥力，土壤有效養分含量較高，肥效較快［5］。不同土壤條件下煙葉質量風格迥異，為研究江西典型特色煙葉的形成機制，本文以K326為材料，比較了旱地紫色土和水田砂壤土條件下煙葉類胡蘿卜素積累、降解規律，以及類胡蘿卜素代謝關鍵酶基因的表達規律，以探索土壤條件對煙葉質量風格影響的代謝機制，為彰顯江西煙葉特色風格奠定理論基礎。

1材料與方法

1．1材料供試品種為K326。試驗于2013年在江西省撫州市廣昌長橋鎮(水田砂壤土)和甘竹鎮(旱地紫色土)。按照當地優質煙栽培技術規范實施管理。在打頂后10，20，30，40d取中部葉片，去除主脈后迅速用錫箔紙包裹后放入液氮冷凍，后置于－80℃冰箱保存。

1．2方法

1．2．1類胡蘿卜素含量檢測將冷凍煙葉用凍干機進行冷凍干燥處理，即為待測樣品。類胡蘿卜素含量的測定采用YC/T382—2010煙草及煙草制品質體色素測定、高效液相色譜法。液相色譜分析儀系統包括Waters2487紫外可見光分光光度檢測器和Waters515泵，Rheodyne7725i型手動進樣閥，Empower色譜工作站。工作條件為:色譜柱:SymmetryC18反相色譜柱(3．9mmi．d．×150mm，5μm，美國Waters公司)。流動相A∶甲醇的異丙醇溶液(體積比為1∶1);流動相B:超純水。流速:0．5mL/min。梯度洗脫:0～10min(70%A+30%B);10～17min(100%A):17～30min(90%A+10%B)。以曲線6線性遞增(減)的梯度條件，平衡10min后手動進樣。進樣量:10μL。檢測波長:450nm。柱溫:室溫。

1．2．2RT-PCR分析按照InvitrogenTRizolReagent說明書進行煙草總RNA的提取，通過隨機引物法反轉錄合成cDNA。采用PremierPrime5．0軟件，根據Genbank的PDS、PSY、ZEP、LCYb、CCD1和L25序列設計各基因擴增引物，進行RT-PCR。其中L25作為內參基因。PCR反應體系為20μL:10μLTaqMix，1μL上游引物，1μL下游引物，2μLcDNA模板，7μL水。擴增程序為:94℃預變性5min;94℃30s變性，50℃30s退火，72℃1min延伸，共33個循環;72℃延伸10min。PCR產物在10g/L瓊脂糖凝膠中電泳后，鑒定其亮度和特異性。

1．2．3類胡蘿卜素降解產物含量測定烤后煙選取C3F等級。采用“水蒸氣蒸餾•二氯甲烷溶劑萃取”法進行前處理后，并用HP5890II-5972氣質連用儀對煙葉樣品進行定性分析。色譜柱為HP-5［60m×0．25mm(i．d．)×0．25m(d．f．)］;載氣及流速為He，0．8mL/min;進樣口溫度為250℃，傳輸線溫度為280℃;離子源溫度為177℃;升溫程序為在50℃停留5min，以每分鐘5℃的升溫速度升至120℃，停留15min，再以每分鐘5℃的升溫速度升至180℃，停留5min，然后以每分鐘6℃的升溫速度升至250℃，停留15min;分流比和進樣量為1∶15，2L，電離能為70eV;電離方式為EI;質量數范圍為50～500Da。采用NIST02譜庫檢索定性。假定相對校正因子為1，采用內標法定量。

2結果與分析

2．1不同土壤煙葉類胡蘿卜素積累規律為比較不同土壤條件下煙葉成熟過程中類胡蘿卜素的積累變化規律，分別在旱地紫色土和水田砂壤土條件下進行K326的規范化種植和管理，并在打頂后不同時間內選取中部葉片(第10～12葉位)進行類胡蘿卜素的檢測和分析(圖1)。可以看出，在不同土壤條件下，隨著葉片發育成熟，煙葉中類胡蘿卜素各組分都呈現總體下降的趨勢。水田砂壤土條件下，煙葉類胡蘿卜素素各組分含量持續下降;但旱地紫色土煙葉在打頂后40d時，β-胡蘿卜素、葉黃素、新黃質含量有明顯回升。在兩種土壤條件下，煙葉紫黃質的含量呈下降的趨勢，打頂后，旱地紫色土的稍高于水田砂壤土;之后，兩者間的差別較小。在葉片成熟過程中，旱地紫色土煙葉中類胡蘿卜素各個組分的含量都明顯高于水田砂壤土煙葉，表明旱地紫色土條件有利于煙葉類胡蘿卜素的積累。

2．2不同土壤煙葉類胡蘿卜素代謝關鍵酶基因表達分析為比較不同土壤條件下煙葉類胡蘿卜素代謝相關基因在轉錄水平的差異，采用半定量RT-PCR技術，分別對旱地紫色土和水田砂壤土條件下K326中部葉片進行類胡蘿卜素相關基因的表達分析，結果如圖2所示。PSY編碼八氫番茄紅素合酶，催化八氫番茄紅素的合成，是類胡蘿卜素生物合成途徑的關鍵調節酶基因［5-8］。在葉片成熟過程中，旱地紫色土煙葉PSY表達逐漸增強，而水田砂壤土煙葉無明顯變化。從表達強度來看，水田砂壤土煙葉PSY基因轉錄水平的表達明顯比旱地紫色土煙葉更為活躍。PDS編碼八氫番茄紅素脫氫酶，催化八氫番茄紅素轉化為ζ－胡蘿卜素，繼而在ζ－胡蘿卜素脫氫酶ZDS催化下生產番茄紅素。PDS的表達在旱地紫色土條件下，隨葉片成熟而逐漸增強，但在水田砂壤土煙葉中的表達豐度明顯較高。LCYb基因編碼番茄紅素－β－環化酶，催化番茄紅素形成β－胡蘿卜素。該基因的表達在水田砂壤土煙葉成熟后期有明顯增強，但在旱地紫色土煙葉成熟后期有所減弱。ZEP基因編碼玉米黃素環氧化酶，催化玉米黃素環氧化形成紫黃質。在葉片成熟過程中，該基因在水田砂壤土煙葉中維持較高的轉錄表達水平。CCD1編碼類胡蘿卜素裂解雙氧合酶，可催化多種類胡蘿卜素底物生成許多天然活性化合物。該基因在旱地紫色土煙葉中的表達持續增強，在水田砂壤土煙葉中表達水平高且穩定。2．3不同土壤煙葉類胡蘿卜素降解產物含量變化分析為比較不同土壤條件下烤煙類胡蘿卜素降解產物的差異，利用HPLC技術對不同土壤煙葉烤后樣C3F進行中性香味物質進行定性、定量分析，結果如表2所示。可以看出，不同土壤煙葉調制后類胡蘿卜素降解產物的種類基本一致，含量較高的有巨豆三烯酮、大馬酮、法尼基丙酮、二氫獼猴桃內酯等幾種物質，其中巨豆三烯酮包括A、B、C、D等4種異構體。從總量上看，不同土壤條件下K326煙葉類胡蘿卜素降解產物差異并不明顯，水田砂壤土略高于旱地紫色土。從類胡蘿卜素降解產物組分看，巨豆三烯酮、二氫大馬酮、香葉基丙酮的含量在旱地紫色土煙葉中較高，β-大馬酮、二氫獼猴桃內酯、法尼基丙酮等含量在水田砂壤土煙葉中較高。另外，番茄紅素的降解產物6-甲基-5-庚烯-2-酮的含量在旱地紫色土煙葉中的含量明顯高于水田砂壤土煙葉。

3討論

煙葉類胡蘿卜素是煙葉重要致香物質的前提物，類胡蘿卜素降解產物的種類和含量直接或間接決定著煙葉的質量和特色［9-13］。類胡蘿卜素相關研究也因此而成為煙草的熱點研究領域。已有的研究證明，類胡蘿卜素的積累和降解過程，隨著煙草品種［14-15］、生長發育時期［16］、生態環境［17-21］、栽培技術［22-25］及調制方法［26-29］的不同而各具特點。土壤條件影響著煙株的生長發育和物質代謝，對煙葉質量和風格具有決定性作用。但關于不同土壤條件下煙葉類胡蘿卜素積累和降解規律、及其代謝關鍵基因表達特征的研究，目前還未見報道。在旱地紫色與和水田砂壤土條件下，針對煙草K326葉片類胡蘿卜素代謝規律進行比較分析。從類胡蘿卜素積累趨勢來看，隨著葉片發育成熟，不同土壤條件下煙葉類胡蘿卜素各組分含量呈現整體下降趨勢，這與前人的研究結果相一致［30-32］。但旱地紫色土條件下，在煙葉成熟后期，即打頂后40d時，β-胡蘿卜素、葉黃素、新黃質的含量表現出上升趨勢;RT-PCR的分析結果也支持了這一結果:類胡蘿卜素合成關鍵酶基因PSY、PDS、ZEP等在打頂后30d和40d的表達有增強趨勢。這可能是由于旱地紫色土質地偏黏，后期雨水過多，影響了煙葉的正常成熟衰老過程所致。在煙葉成熟的過程中，旱地紫色土煙葉中除紫黃質以外，β-胡蘿卜素、葉黃素、新黃質的積累水平都高于水田砂壤土煙葉。然而，從基因表達來看，無論是類胡蘿卜素合成相關基因PSY、PDS、LCYb、ZEP，還是類胡蘿卜素降解相關基因CCD1，皆在水田砂壤土煙葉中更加活躍，表明水田砂壤土條件更有利于類胡蘿卜素的合成和降解。由此推測，旱地紫色土煙葉中類胡蘿卜素的高水平積累，主要是由于類胡蘿卜素降解水平較低所致。烤后煙葉中，旱地紫色土類煙葉胡蘿卜素的降解產物雖然總量上并不占優勢，但種類上有較大差異。旱地紫色土煙葉中，如巨豆三烯酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二氫大馬酮、香葉基丙酮等明顯高于水田砂壤土煙葉，而β-大馬酮、二氫獼猴桃內酯、法尼基丙酮在水田砂壤土煙葉中含量較高。推測這些物質可能對紫色土煙葉風格特征的形成具有較大的影響。類胡蘿卜素及其降解產物是煙葉重要的致香成分，對煙葉質量和風格的影響顯著。近年來對江西煙葉檢測分析結果表明，煙葉類胡蘿卜素降解產物含量整體偏低(通信交流)，這可能是制約江西煙葉質量提高和特色彰顯的主要原因之一。雖然旱地紫色土煙葉中類胡蘿卜素較高，但烤后煙中類胡蘿卜素降解產物總量并不高，這可能受到現有烘烤工藝的限制。因而，根據不同的土壤條件，進行個性化的煙草栽培管理以提高煙葉類胡蘿卜素的積累水平，制定個性化煙葉調制策略以提高類胡蘿卜素的降解效率，是彰顯江西煙葉特色風格的重要途徑之一。

參考文獻:

［1］李潤田．中國煙草地理［M］．北京:農業出版社，1988:30-31．LiRT．GeographyoftobaccoinChina［M］．Beijing:AgriculturalPublishingHouse，1988:30-31．

［2］逄濤，林茜，李勇．云南煙區不同土壤類型對K326烤煙主要化學成分的影響［J］．安徽農業科學，2012，40(16):8897-8898．

作者：王晶 楊永霞 馮小虎 程謙 楊勝男 何朋朋 崔紅 單位：國家煙草栽培生理生化研究基地/河南農業大學煙草學院 江西省煙草公司撫州市公司 江西省撫州市煙草公司廣昌分公司