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《四川動(dòng)物雜志》2016年第二期

摘要：

以3種細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)為供試菌，測(cè)定了長(zhǎng)足大竹象雄性附腺提取物的抑菌活性。結(jié)果表明：長(zhǎng)足大竹象雄性附腺提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性。不同濃度的粗提物對(duì)枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌抑菌影響均差異顯著，抑菌活性隨著雄性附腺粗提物濃度的增加而增強(qiáng)。附腺粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為0.2mg•mL-1、0.4mg•mL-1。不同處理溫度對(duì)長(zhǎng)足大竹象雄性附腺粗提物的抑菌作用有一定影響。

關(guān)鍵詞：

長(zhǎng)足大竹象；雄性附腺；抑菌作用

長(zhǎng)足大竹象Cyrtotrachelusbuqueti又名竹橫錐大象，屬昆蟲綱鞘翅目象甲科的昆蟲，國(guó)內(nèi)主要分布于重慶、廣東、廣西等地。長(zhǎng)足大竹象是竹林主要害蟲，國(guó)家林業(yè)局將它列為我國(guó)林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物之一(王維德等，2002)。由于昆蟲的生殖道直接與體內(nèi)環(huán)境相連，是潛在的微生物通道，有時(shí)可能會(huì)消極地影響繁殖的成功率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，為了防止有害細(xì)菌或真菌的入侵，許多昆蟲的生殖系統(tǒng)中能產(chǎn)生抗菌肽，包括雄性附腺。將未交配的雌蟲與剛交配的黑腹果蠅的雌蟲生殖道作對(duì)比，發(fā)現(xiàn)后者被增加了3種抗菌蛋白，其中蛋白之一(28kDa)是雄性附腺的產(chǎn)物(Lung&Wolfner，1999)；這些蛋白在交配過(guò)程中比精子先轉(zhuǎn)入到雌蟲體內(nèi)，使得交配后的雌蟲生殖道和卵都能抵抗細(xì)菌的侵染；在精子進(jìn)入后，在雄蟲生殖道內(nèi)的這些蛋白可以保護(hù)精子免受細(xì)菌的侵害(Lung&Wolfner，2001)。目前有關(guān)昆蟲雄性附腺抑菌的研究已經(jīng)有了一些報(bào)道，研究對(duì)象主要集中在作為生物學(xué)模式物種的果蠅(Wolfner，2002；Ram&Wolfner，2007)。本研究首次對(duì)長(zhǎng)足大竹象雄性附腺抑菌作用進(jìn)行研究，為下一步的長(zhǎng)足大竹象雄性附腺生理功能研究提供有價(jià)值的資料。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx2014年8月初，在樂(lè)山師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)竹林罩網(wǎng)，采集捕捉竹筍上剛出土長(zhǎng)足大竹象成蟲，根據(jù)蟲的外形特征來(lái)判斷雌雄。隨機(jī)采集體型中等大小的雌、雄蟲各50頭，在溫度25℃、相對(duì)濕度75%、光周期16L:8D下以盆栽竹筍喂食在室內(nèi)飼養(yǎng)，每2d更換1次竹筍，讓其自由交配；用紅外攝像系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其交配情況，雄蟲交配一旦結(jié)束，隨即采其附腺體或?qū)⑿巯x轉(zhuǎn)移至新飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分別采集剛出土，出土24h，交配后0h、2h、12h、24h、48h的雄蟲附腺進(jìn)行內(nèi)容物蛋白含量測(cè)定。

1.2主要儀器高壓蒸汽滅菌鍋(YX-18LM)、冷凍干燥箱(HDR-100HP)、恒溫水浴鍋、電子天平(BSS224S)、游標(biāo)卡尺、841型遠(yuǎn)紅外電子專用干燥箱、移液槍、冷凍高速離心機(jī)(TGL-20MB/TGL-20M)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(K1901)。大腸桿菌Escherichiacoli、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus以及其他分析純等均由樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1雄蟲附腺內(nèi)容物樣品制備按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，選取各采樣節(jié)點(diǎn)雄蟲7頭，在4℃昆蟲生理鹽水(NaCl6.8g，CaCl20.2g，KCl0.2g，MgCl2•6H2O0.2g，NaHCO30.15g，葡萄糖7.7g，ddH2O1000mL)中解剖雄蟲，取出完整的大小雄性附腺，放入500μL磷酸緩沖液(pH6.86)中冰浴勻漿。10000r/min離心10min，取上清液，沉淀再用少量緩沖液清洗，離心后，收集上清液，合并相同上清液為一管，定容至1mL，-20℃保存?zhèn)溆茫糜谝志钚詼y(cè)定。

1.3.2雄蟲附腺內(nèi)容物樣品蛋白含量測(cè)定利用Bradford法(Bradford，1976)，建立牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別用移液槍加入不同時(shí)期適量樣品各自定容到1mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白質(zhì)試劑，充分混合，放置2min后以空白為對(duì)照，測(cè)定其吸光值595nm，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得各待測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的含量。最終確定雄蟲附腺內(nèi)容物樣蛋白含量較高的時(shí)期。

1.3.3雄性附腺蛋白干粉的制備選擇蛋白含量較高時(shí)期的雄蟲將其附腺內(nèi)容物樣品進(jìn)行冷凍干燥，制成蛋白干粉，-70℃貯存。

1.3.4培養(yǎng)基及無(wú)菌平板的制備固體培養(yǎng)基及無(wú)菌平板的制作參照沈萍等(1999)的方法。

1.3.5菌種的活化及菌懸液制備取3支已滅菌的試管，每支試管倒入一定量(不超過(guò)試管的1/5)的培養(yǎng)基，制成斜面(斜面不超過(guò)試管的1/2)，取供試菌種1環(huán)劃線培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌37℃培養(yǎng)24h，空白對(duì)照用無(wú)菌蒸餾水配制，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)，使菌懸液濃度為5×106~5×107個(gè)/mL，備用。

1.3.6含菌平板的制備將上述各培養(yǎng)基滅菌后倒于培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿約20mL。待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌移液槍準(zhǔn)確吸取上述各種菌懸液0.2mL注入培養(yǎng)皿內(nèi)，再用滅過(guò)菌的涂布棒迅速將菌液涂抹均勻，制成指示含菌平板。

1.3.7抑菌性的測(cè)定將附腺蛋白含量最高時(shí)樣品制備的蛋白干粉溶解于預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水，分別配成3.2mg•mL-1、0.8mg•mL-1樣品溶液，將滅菌的6mm的圓形濾紙片分別置于這兩種濃度的雄蟲附腺溶液中浸泡1h，用已滅菌的鑷子取浸泡過(guò)的濾紙片，放置于含菌平板中，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)板，空白對(duì)照為無(wú)菌蒸餾水。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌37℃培養(yǎng)24h，取出，觀察是否有抑菌圈，若有，則用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(包括濾紙片直徑)。

1.3.8最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定用倍比稀釋，將附腺蛋白含量最高時(shí)的內(nèi)容物溶液稀釋成1.6、0.8、0.4、0.2、0.1mg•mL-15個(gè)濃度。每支試管中加入0.2mL對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)菌懸液，并用PBS作陰性對(duì)照，將不同濃度的內(nèi)容物稀釋液加入到菌懸液試管中，吸取0.3mL混合液涂布培養(yǎng)基平板上，置于37℃下培養(yǎng)24h，觀察平板內(nèi)有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低粗提取濃度作為最小抑菌濃度(溫旺榮等，1994)。每個(gè)濃度重復(fù)3次。

1.3.9溫度對(duì)長(zhǎng)足大竹象雄性附腺抑菌影響分別取200μL附腺蛋白含量最高時(shí)的內(nèi)容物溶液放入不同的滅菌試管中，將試管分別置于3、16、18、22、24、28、30℃下處理30min，根據(jù)“1.3.7”測(cè)定結(jié)果選擇適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)足大竹象雄性附腺內(nèi)容物抑菌濃度，重復(fù)“1.3.7”的步驟比較不同的溫度對(duì)長(zhǎng)足大竹象雄性附腺抑菌活性的影響。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)的整理和分析均用Microsoft的Excel2000軟件及SPSS軟件進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1長(zhǎng)足大竹象雄性附腺不同發(fā)育時(shí)期蛋白含量不同發(fā)育時(shí)期長(zhǎng)足大竹象雄性附腺蛋白含量如表1所示，剛出土的長(zhǎng)足大竹象成蟲雄性附腺中蛋白含量為568.75μg/頭±13.12μg/頭，在出土12h內(nèi)蛋白增長(zhǎng)十分迅速，增加了10.85%，蛋白含量達(dá)到630.43μg/頭±12.45μg/頭。而后蛋白含量的增長(zhǎng)趨于緩和，到出土24h，達(dá)到640.57μg/頭±36.79μg/頭，蛋白含量最高。交配后2h內(nèi)蛋白含量迅速下降，較追尾時(shí)下降9.29%；交配后的2~12h蛋白含量下降趨于穩(wěn)定。交配12h后蛋白含量又急劇增加，達(dá)到608.36μg/頭±14.56μg/頭。到交配后的48h基本上恢復(fù)到出土24h水平。通過(guò)兩兩差異顯著性檢驗(yàn)，除出土12h、出土24h和預(yù)交配0h三個(gè)時(shí)間段外，其他各個(gè)時(shí)期蛋白含量的變化差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。出土24h長(zhǎng)足大竹象雄性附腺蛋白含量基本上達(dá)到最高，最終選擇出土24h長(zhǎng)足大竹象雄性附腺蛋白樣品進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

2.2抑菌活性的測(cè)定長(zhǎng)足大竹象雄性附腺內(nèi)容物粗提物的抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表1，其內(nèi)容物的粗提物對(duì)屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌沒(méi)有抑菌作用，但對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，與空白對(duì)照相比，不同濃度的粗提物對(duì)枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌抑菌活性影響差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，抑菌活性隨著雄性附腺粗提物濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)長(zhǎng)足大竹象雄性附腺粗提物濃度為0.8mg•mL-1時(shí)，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)平板上的抑菌圈直徑分別為11.16mm、10.62mm。低于頭孢霉素在0.8mg•mL-1濃度時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)平板上的抑菌圈直徑(15.78mm、17.22mm)(向玉勇等，2013)。

2.3最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定長(zhǎng)足大竹象雄性附腺粗提物最小抑菌濃度的結(jié)果如表2所示，從表中可以看出附腺粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為0.2mg•mL-1、0.4mg•mL-1。

2.4溫度對(duì)長(zhǎng)足大竹象雄性附腺抑菌影響不同溫度對(duì)長(zhǎng)足大竹象雄性附腺粗提物的抑菌作用有一定影響，依據(jù)樂(lè)山地區(qū)全年平均最低溫度和最高溫度，設(shè)置3℃和30℃為邊界溫度，從表3可以看出邊界溫度條件下抑菌圈非常小，抑菌活性較低。隨著對(duì)長(zhǎng)足大竹象雄性附腺粗提物處理溫度的升高，其抑菌作用明顯呈先上升后下降的趨勢(shì)。通過(guò)兩兩差異顯著性檢驗(yàn)，28℃下粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑與其他溫度下的對(duì)兩菌抑菌圈直徑差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3結(jié)論與討論

從20世紀(jì)50年代開(kāi)始，有關(guān)雙翅目、鱗翅目、直翅目、鞘翅目等多個(gè)目昆蟲雄性附腺的研究已經(jīng)有了一些報(bào)道(Chapman&Davies，2004；高潔等，2008)。但對(duì)于雄性附腺抗菌性的研究，迄今為止，在鞘翅目昆蟲中尚未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，我們用濾紙片法首次證明長(zhǎng)足大竹象雄性附腺中存在抗菌蛋白，并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性。對(duì)大腸桿菌的抑制效果不明顯，可能是因?yàn)榇竽c桿菌為普遍存在物種，也為長(zhǎng)足大竹象體內(nèi)的天然共生群，因此未檢測(cè)到抑菌效果。這與其他學(xué)者對(duì)棕尾別麻蠅雄性附腺抑菌的研究結(jié)果相同，并且其抑菌活性明顯高于棕尾別麻蠅雄性附腺對(duì)該枯草芽孢桿菌的抑菌活性(高熹等，2007)。

在0.8mg•mL-1時(shí)本實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)足大竹象雄性附腺粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑(10.62mm)低于家蠅血淋巴粗提物對(duì)該菌的抑菌圈直徑(12.22mm)(向玉勇等，2013)。這可能是因?yàn)槔ハx抗菌肽一般是在血淋巴及消化道中產(chǎn)生的一類抗菌肽，專職于免疫功能的淋巴液中含有更多、更強(qiáng)的抑菌物質(zhì)(孫恩濤，秦志輝，2006)。本研究用濾紙片法測(cè)定的長(zhǎng)足大竹象雄性附腺最小抑菌濃度均已超出常規(guī)的敏感判定，一方面可能與抗菌肽是一類小分子，在組織內(nèi)含量低，另一方面可能與使用的是長(zhǎng)足大竹象雄性附腺的粗提物質(zhì)，而不是分離純化出的純抗菌蛋白有關(guān)。究竟是何種抗菌肽,是一種或是幾種抗菌蛋白綜合起作用需要進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)不同溫度處理，發(fā)現(xiàn)溫度是影響長(zhǎng)足大竹象雄性附腺粗提物抑菌活性的因素，在28℃下的粗提物抑菌效果最好。根據(jù)本文的結(jié)果，在長(zhǎng)足大竹象出土高峰期，可以通過(guò)觀測(cè)竹林區(qū)溫度并結(jié)合其他氣候指標(biāo)，對(duì)長(zhǎng)足大竹象進(jìn)行及時(shí)防治。本研究結(jié)果可為制定經(jīng)濟(jì)合理的防治方案提供一定的參考依據(jù)。本研究所用的是長(zhǎng)足大竹象雄性附腺粗提物，為深入探討其活性物質(zhì)的抑菌機(jī)理，及進(jìn)一步揭示生殖附腺在生殖生理中的特殊功能，需要我們對(duì)粗提物進(jìn)行分離純化，從而為開(kāi)展更為深入的研究以及從生殖的角度找到一條切實(shí)可行的防治對(duì)策建立基礎(chǔ)。

作者：梁梓 杜超豪 楊瑤君 農(nóng)向 廖鴻 顏珊 單位：樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院