EPSP合酶的研究進(jìn)展范文
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《生物技術(shù)通報(bào)雜志》2014年第七期
1莽草酸途徑簡(jiǎn)介
莽草酸途徑是存在于植物、細(xì)菌和真菌中的一條重要代謝途徑，而動(dòng)物體內(nèi)的代謝中是不存在此途徑的，此途徑使糖代謝和次生代謝緊密地聯(lián)系在一起。該途徑有7個(gè)酶參與催化反應(yīng)，并且這7個(gè)酶都可以通過真核和原核細(xì)胞來源的基因表達(dá)獲得。第一步反應(yīng)是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤蘚糖-4磷酸（E4P）的反應(yīng)。PEP和E4P分別是由糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑產(chǎn)生的物質(zhì)。最后一步反應(yīng)是分支酸的生成。分支酸不僅是莽草酸途徑的終產(chǎn)物，也是3種芳香族氨基酸和一些次生代謝產(chǎn)物的主要前體。分支酸的去向如圖1所示。植物的次生代謝產(chǎn)物合成途徑包括苯丙烷代謝途徑、異戊二烯代謝途徑和生物堿合成途徑等。研究表明，許多次生代謝產(chǎn)物的芳香族氨基酸前體都是來自莽草酸途徑產(chǎn)生的芳香族氨基酸及其中間產(chǎn)物，因此莽草酸途徑在合成有商業(yè)價(jià)值的天然產(chǎn)物過程中起著非常重要的作用。莽草酸途徑在植物中的重要性也得到證實(shí)，由莽草酸途徑產(chǎn)生的物質(zhì)大約占植物干重的35%以上。由于莽草酸途徑在哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類、爬行動(dòng)物和昆蟲中是不存在的，近年來它逐漸成為抗菌素、除草劑和活體疫苗的靶標(biāo)。例如，由惡性瘧原蟲引起的瘧疾，每年大約200多萬人死于這種疾病，科學(xué)家利用莽草酸途經(jīng)尋找新型的抗瘧疾藥，目前草甘膦作為瘧疾的療效藥已經(jīng)在小鼠身上成功試驗(yàn)。
目前EPSP合酶被分為兩種類型，類型I包括來源于大腸桿菌（Escherichiacoli）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）的EPSP合酶；類型II包括來源于覆盆子土壤桿菌（Agrobacteriumtumefacienssp.CP4）、無色桿菌（Achromobactersp.LBAA）、假單胞菌（Pseudomonassp.PG2982）等。類型II的EPSP合成酶多克隆抗體與類型I的EPSP合酶不會(huì)發(fā)生抗原抗體交叉反應(yīng)，而且兩種類型序列一致性30%左右。I型EPSP合酶對(duì)除草劑草甘膦敏感。II型EPSP合酶在草甘膦存在時(shí)，相對(duì)于I型EPSP合酶表現(xiàn)出更高的催化效率。研究人員將II型EPSP合酶轉(zhuǎn)入作物中可以對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性，顯著有效的控制了田間雜草。目前已知的II型EPSP合酶都是在微生物中存在的。在今天市場(chǎng)上銷售的大多數(shù)耐草甘膦產(chǎn)品都含有農(nóng)桿菌CP4-EPSPS。Della-Cioppa等發(fā)現(xiàn)在植物細(xì)胞中，前體EPSP合酶存在于細(xì)胞核中，但是當(dāng)該酶變?yōu)槌墒斓腅PSP合酶（Matureenzyme）時(shí)，是存在于葉綠體內(nèi)。EPSP合酶是通過前體EPSP合酶合成的。絕大多數(shù)植物的EPSP合酶的活性中心存在于葉綠體中。前體EPSP合成酶也具有催化活性，并且它的催化活性也受到草甘膦的抑制。前體EPSP合酶的N端為信號(hào)肽所在的位置。信號(hào)肽的主要作用是引導(dǎo)EPSP合酶進(jìn)入葉綠體基質(zhì)，之后信號(hào)肽被水解，前體蛋白就變成成熟的EPSP合酶。例如，童旭宏等發(fā)現(xiàn)陸地棉EPSP合酶基因編碼521個(gè)氨基酸殘基，前74個(gè)氨基酸殘基為運(yùn)輸肽，當(dāng)前體EPSP合酶進(jìn)入葉綠體后經(jīng)加工剪切信號(hào)肽，變成成熟EPSP合酶。成熟EPSP合酶包含447個(gè)氨基酸，比前體EPSP合酶氨基酸少了74個(gè)氨基酸，分子量約為48kD。信號(hào)肽對(duì)于EPSP合酶定位于葉綠體起著決定性的作用。微生物的EPSP合酶存在于細(xì)胞質(zhì)中，并且沒有一段氨基酸序列在N端，所以微生物EPSP合酶無信號(hào)肽。我們通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)把微生物的EPSP合酶基因?qū)胫参镏须m然能夠成功表達(dá)EPSP合酶，但是不能進(jìn)入葉綠體，如果加上信號(hào)肽序列，就能把表達(dá)的EPSP合酶定位到葉綠體上。植物中的EPSP合酶主要存在葉片、根、頂端分生組織、嫩葉和胚芽鞘中，葉片中合成大量的芳香族氨基酸，而在根、頂端分生組織、嫩葉和胚芽鞘中既能夠自身合成，也能吸收葉片中的芳香族氨基酸。
3EPSP合酶的三維結(jié)構(gòu)與活性區(qū)
Krekel等成功純化出大腸桿菌的EPSP合酶。通過對(duì)此酶核磁共振及晶體衍射研究分析發(fā)現(xiàn)，其合酶由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)相同的βαβαββ折疊單位，每個(gè)折疊單位由兩個(gè)平行的α螺旋和4個(gè)β折疊組成（圖2）。研究人員發(fā)現(xiàn)大腸桿菌EPSP合酶共有427個(gè)氨基酸殘基，PEP結(jié)合位點(diǎn)與Lys-22、Arg-124、Asp-313、Arg-344、Arg-386和Lys-411這6個(gè)氨基酸殘基有關(guān)，Arg-27與莽草酸-3-磷酸（S3P）結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。EPSP合酶蛋白的N端和C端都在同一個(gè)結(jié)構(gòu)域中，PEP主要與EPSP合酶的C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而S3P與EPSP合酶主要結(jié)合在N端結(jié)構(gòu)域［29-31］。兩個(gè)平行的α螺旋在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間形成了可以吸引負(fù)電荷基團(tuán)的正電荷區(qū)。EPSP合酶存在狀態(tài)分為兩種：一種是開放（Open）狀態(tài)（圖3-a），當(dāng)沒有底物與合酶結(jié)合，且兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相距較遠(yuǎn)時(shí)存在的狀態(tài)；當(dāng)酶與底物S3P結(jié)合時(shí)，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互靠近，并且在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間裂縫中出現(xiàn)酶的活性位點(diǎn)，這時(shí)合成酶存在的狀態(tài)為關(guān)閉（Closed）狀態(tài)（圖3-b）。
在關(guān)閉狀態(tài)下，采用限制性胰消化酶也很難使其消化，在開放口的90-102位氨基酸及附近的1區(qū)（123-134位氨基酸）、2區(qū)（140-152位氨基酸）、3區(qū)（355-366位氨基酸）與底物結(jié)合，從而避免了這些區(qū)域被消化，通過這個(gè)試驗(yàn)確定了EPSP合酶的活性區(qū)域。如果將EPSP合酶與底物結(jié)合區(qū)域的某些氨基酸殘基替代，如將Gly96改為Ala、Pro101改為Ser，則草甘膦就很難與合酶結(jié)合，這時(shí)該酶表現(xiàn)出耐草甘膦的特性。易弋等對(duì)鹽藻的EPSP合酶三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)并對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，鹽藻EPSP合酶的氨基酸序列與高等植物、細(xì)菌一樣，都有開放和關(guān)閉兩種狀態(tài)，并且都含有3處氨基酸序列非常保守的區(qū)域，這些非常保守的區(qū)域就是EPSP合酶與酶底物PEP、S3P或草甘膦結(jié)合的活性位點(diǎn)，如果改變保守區(qū)域中的一個(gè)位點(diǎn)，那么酶的活性將會(huì)改變，草甘膦的抑制作用也會(huì)減弱。研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和植物的EPSP合酶是一個(gè)單體酶，分子量大約為44-48kD。而真菌的EPSP合酶屬于AROM蛋白結(jié)構(gòu)域中的其中一個(gè)，AROM蛋白通常是以二聚體形式存在的，單體形式下沒有催化活性，分子量比較大，最多含有1618個(gè)氨基酸，最少含有1563個(gè)氨基酸，而且AROM蛋白是一個(gè)同時(shí)具有脫氫奎尼酸合酶、脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶和EPSP合酶活性的5功能多肽，催化真菌中芳香族氨基酸合成途徑的第3步到第6步的反應(yīng)。
4EPSP合酶的催化機(jī)制
EPSP合酶作為莽草酸途徑的第6位酶，參與合成芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸）和許多次生代謝產(chǎn)物，如泛醌（Ubinquinone），維生素K（Vitamink），維生素K2類（Menaquinone）等。EPSP合酶催化烯醇式丙酮酸基團(tuán)從PEP轉(zhuǎn)化到S3P上形成產(chǎn)物EPSP，并釋放出一分子無機(jī)磷，這個(gè)化學(xué)反應(yīng)是PEP的C-O鍵裂解而不是經(jīng)過P-O鍵的裂解，并且在PEP上發(fā)生乙烯基質(zhì)子的交換。之前有研究者認(rèn)為合酶與底物的結(jié)合是隨機(jī)的，但是通過用動(dòng)力學(xué)優(yōu)化的底物誘導(dǎo)試驗(yàn)證實(shí)了酶與底物結(jié)合是有先后順序的。1988年，Wibbenmeyer等將大腸桿菌EPSP合酶純化，當(dāng)純度達(dá)到97%以上時(shí)，通過核磁共振（NMR）和快速淬火動(dòng)力學(xué)（Raidquenchkinetics）方法得到了EPSP合酶催化S3P和PEP的反應(yīng)是一個(gè)縮合反應(yīng)，EPSP合酶和S3P及PEP形成了一個(gè)四面體過渡態(tài)Ⅰ，并伴隨著生成一個(gè)EPSP縮酮副產(chǎn)物Ⅱ，過渡態(tài)Ⅰ隨后生成EPSP并釋放一分子無機(jī)磷（圖4-a）。1997年，Studelska等利用固體核磁共振（Solid-stateNMR）方法對(duì)EPSP合酶的催化機(jī)理重新進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)PEP首先和EPSP合酶形成過渡態(tài)A、B，之后與S3P結(jié)合形成合酶縮酮過渡態(tài)C，而后生成EPSP（圖4-b），這種催化機(jī)理也得到了研究者的證實(shí)。
5EPSP合酶基因及表達(dá)
目前已經(jīng)從細(xì)菌，真菌和植物中分離克隆出許多EPSP合酶基因。在原核生物中，許多EPSP合酶基因被克隆與分析。1984年，Duncan等［44，47］首次克隆出長(zhǎng)度為1284bp，編碼427個(gè)氨基酸殘基的E.coliEPSP合酶基因，并且該基因內(nèi)沒有內(nèi)含子。Comai等對(duì)鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellavtyphimurium）EPSP合酶基因進(jìn)行克隆發(fā)現(xiàn)，基因編碼427個(gè)氨基酸，合酶蛋白的分子量約為46kD。有研究者對(duì)大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌的EPSP合酶基因進(jìn)行了對(duì)比發(fā)現(xiàn)，二者的核苷酸序列差異為21%，同義密碼子有78%在第1位或第二位堿基上發(fā)生變化，65%在第3位堿基上變化，氨基酸序列的同源性為93%，并且兩種多肽的15個(gè)N端氨基酸殘基也是相同的，在86-131位氨基酸之間的區(qū)域?yàn)楦叨缺Ｊ貐^(qū)域，而在302-371和381-422位氨基酸之間的區(qū)域?yàn)镃端高度保守區(qū)域。脯氨酸分別位于這兩種合酶序列中的不同位置，位于鼠傷寒沙門氏菌EPSP合酶序列的85位上，而在大腸桿菌中位于合酶序列的81位上，并且在81-85位的氨基酸殘基在鼠傷寒沙門氏菌EPSP合酶序列中是不存在的，兩者其它部位的脯氨酸是完全保守的。在真菌中，許多EPSP合酶基因也被克隆與分析。Charles等報(bào)道了真菌構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans）的EPSP合酶基因，其合酶屬于AROM蛋白結(jié)構(gòu)域中的其中一個(gè)，基因中含有一個(gè)單一的閱讀框架，長(zhǎng)度為5311bp。于海濤等克隆分離得到了假絲酵母TY-JM和黃曲霉TZ1985的EPSP合酶蛋白編碼序列。假絲酵母TY-JM的EPSP合酶編碼序列長(zhǎng)度為1311bp，編碼436個(gè)氨基酸，理論分子量為46kD，黃曲霉TZ1985的EPSP合酶編碼序列長(zhǎng)度為1353bp，編碼450個(gè)氨基酸，理論分子量為48kD。通過與其它物種EPSP合酶氨基酸序列對(duì)比分析，TY-JMEPSP合酶基因與杜氏假絲酵母、熱帶假絲酵母和白假絲酵母等物種的同源性為80%，而與棒曲霉、核盤菌的同源性為66%，TZ1985EPSP合酶基因與土曲霉、煙曲霉、白曲霉和黑曲霉的同源性為90%，而與白假絲酵母、杜氏假絲酵母和熱帶假絲酵母的同源性為68%。在進(jìn)化關(guān)系上，TY-JMEPSP合酶和TZ1985EPSP合酶與真菌的EPSP合酶有很近的親緣關(guān)系，而與植物和細(xì)菌的EPSP合酶親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。
在植物中，一些EPSP合酶基因也被克隆與分析。Wang等發(fā)現(xiàn)煙草中有兩種EPSP合酶基因的cDNA，兩種cDNA的長(zhǎng)度分別為2000bp和1300bp，二者編碼的氨基酸序列和核苷酸序列的同源性分別為95.9%和89%，但是兩種EPSP合酶的酶活力相同。劉曉軍等從諸葛菜中也克隆出兩段EPSP合酶基因片段，其中一段長(zhǎng)為797bp，另一段長(zhǎng)為1157bp，兩個(gè)片段的外顯子序列是完全相同的，內(nèi)含子相差很大，但是這兩段基因編碼出相同的EPSP合酶，這兩個(gè)片段所編碼氨基酸序列與歐洲油菜、玉米、擬南芥、黑麥草、水稻及矮牽牛的一致性分別為85%、80%、83%、80%、79%和79%。Gasser等通過對(duì)比細(xì)菌、植物和真菌的EPSP合酶編碼區(qū)，獲得了一個(gè)比較一致的模式（圖5），三者EPSP合酶中約有38%的氨基酸殘基相同，細(xì)菌和植物之間EPSP合酶的同源性為54%，真菌和植物之間EPSP合酶的同源性為38%，這些數(shù)據(jù)表明真菌和植物中的EPSP合酶的分枝比細(xì)菌和植物中此酶的分枝出現(xiàn)的早。
研究者發(fā)現(xiàn)EPSP合酶基因在生物不同的組織中表達(dá)也是有差異的，在矮牽牛中其基因表達(dá)量最高的組織是花瓣，在銀杏中表達(dá)量最高的是在果實(shí)和葉子中；其次為莖，最低的是在根中。木本植物喜樹EPSP合酶基因表達(dá)量最高的組織是在葉子，根中表達(dá)量最低。薤白EPSP合酶基因在幼葉中表達(dá)量最高，而在壯葉和莖中表達(dá)量最低。出現(xiàn)這種表達(dá)差異的原因可能是由于EPSP合酶基因在不同的組織中發(fā)生轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)不相同，也有研究者認(rèn)為黃酮含量也與不同組織中EPSP合酶基因的表達(dá)量有關(guān)。另一方面，有研究者報(bào)道，改變高度保守區(qū)域的氨基酸殘基，可使EPSP合酶與草甘膦的結(jié)合能力發(fā)生改變，從而使生物表現(xiàn)出抗草甘膦特性。
6EPSP合酶基因的應(yīng)用
EPSP合酶不僅是除草劑草甘膦作用的靶標(biāo)，也可以作為抗菌素和抗寄生蟲藥物的靶標(biāo)；另一方面，EPSP合酶活性大小對(duì)生物體內(nèi)莽草酸的積累有重要影響。
6.1草甘膦及抗草甘膦EPSP合酶基因
6.1.1草甘膦及其與EPSP合酶作用機(jī)制草甘膦作為一種非選擇性除草劑，在殺死雜草的同時(shí)，也會(huì)殺死農(nóng)作物，從而限制了草甘膦的使用范圍和時(shí)間，自1974年在美國注冊(cè)登記以來，已成為當(dāng)今世界上銷售量最大且使用最廣的農(nóng)藥品種，問世30多年來經(jīng)久不衰。草甘膦與EPSP合酶的作用機(jī)制是：草甘膦與PEP在結(jié)構(gòu)上非常相似，在莽草酸途徑中草甘膦占據(jù)了EPSP合酶和PEP的連接位點(diǎn)，形成EPSP合酶•S3P•glyphosate的復(fù)合物，使EPSP合酶催化烯醇式丙酮酸基團(tuán)從PEP轉(zhuǎn)化到S3P上形成EPSP的過程停止，競(jìng)爭(zhēng)性抑制EPSP合酶的活性導(dǎo)致芳香族氨基酸和一些芳香化合物合成受阻，最終導(dǎo)致一些關(guān)鍵性代謝物和激素如酚類化合物、木質(zhì)素、代謝失調(diào)，使生物體不能進(jìn)行正常的氮代謝而死亡，而且EPSP合酶進(jìn)入葉綠體的過程也受草甘膦的抑制。
6.1.2抗草甘膦EPSP合酶基因來源1983年，Comai等從鼠傷寒沙門菌中分離克隆出了抗草甘膦的突變基因——aroA基因，此后許多研究者對(duì)抗草甘膦基因進(jìn)行了深入廣泛的研究。抗草甘膦的EPSP合酶基因主要來源于微生物和植物，而且研究者發(fā)現(xiàn)植物中的EPSP合酶比細(xì)菌中EPSP合酶對(duì)草甘膦的抗性大約低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。表1為目前已獲得的主要抗草甘膦EPSP合酶基因及其來源。目前獲得抗草甘膦EPSP合酶編碼基因的途徑主要有兩種：第1種是從天然抗草甘膦的物種或突變體中克隆分離出抗草甘膦基因或突變基因。在天然抗草甘膦基因中，土壤農(nóng)桿菌CP4-EPSP合酶基因是應(yīng)用最廣泛的抗草甘膦EPSP合酶基因，并形成商業(yè)化生產(chǎn)。除此之外，研究者從一些物種的突變體中克隆分離出抗草甘膦突變基因，如研究者克隆大豆、油菜、馬鈴薯及擬南芥抗草甘膦的EPSP合酶突變基因發(fā)現(xiàn)，大豆EPSP合酶基因編碼的104Gly突變?yōu)锳la，油菜EPSP合酶基因編碼的Gly96突變?yōu)锳la，馬鈴薯和擬南芥EPSP合酶第101位上Gly變?yōu)锳la。Shah等從篩選出的抗草甘膦矮牽牛MP4——G細(xì)胞系中克隆出EPSP合酶的cDNA，將其cDNA導(dǎo)入矮牽牛葉片后，對(duì)草甘膦的抗性明顯提高。Scott等發(fā)現(xiàn)牛筋草的EPSP合酶基因發(fā)生突變，第101位脯氨突變?yōu)樯彼岷螅瑢?duì)草甘膦具有很低的敏感度，表現(xiàn)出抗草甘膦。第2種是利用遺傳學(xué)方法改造EPSP合酶編碼基因，提高對(duì)草甘膦的抗性：定點(diǎn)突變可以減小酶與草甘膦的親和力或提高酶與底物的親和力，從而提高對(duì)草甘膦的抗性。Tian等利用定點(diǎn)突變使蘋果的EPSP合酶基因編碼的Thr101變?yōu)锳la，Ala187變?yōu)門hr，通過動(dòng)力學(xué)分析證實(shí)兩個(gè)氨基酸突變后提高了對(duì)草甘膦的抗性；Ming等使用易錯(cuò)傾向PCR隨機(jī)突變技術(shù)使來源于大腸桿菌和沙門氏菌的aroA基因發(fā)生突變和重組，得到aroM1、aroM2、aroM3和aroM44種突變體，通過EPSP合酶活性的動(dòng)力學(xué)分析表明，4種突變體的4個(gè)突變基因編碼的EPSP合酶的活性比突變前提高了2-10倍，與烯醇式丙酮酸的親和性提高了2.5-19倍，與草甘膦的Ki值提高了0.4-8倍；Lebrun等使用定點(diǎn)突變，從玉米中克隆獲得了抗草甘膦的CP4基因，而且先正達(dá)公司通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)開發(fā)出了耐草甘膦玉米品種GA21。研究者發(fā)現(xiàn)，通過遺傳學(xué)方法改造EPSP合酶編碼基因，雖然提高了生物對(duì)草甘膦的抗性，但是也降低了EPSP合酶的催化活性，因此，目前改造成功并用于商業(yè)化生產(chǎn)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的基因幾乎全部是CP4-EPSP合酶基因。
6.2在抗菌素和抗寄生蟲藥物上的應(yīng)用EPSP合酶可以作為抗菌素的靶標(biāo)，如研究者通過試驗(yàn)刪除肺炎鏈球菌和支氣管炎博德特菌的EPSP合酶的基因后，發(fā)現(xiàn)二者的毒性減弱。在抗寄生蟲藥物方面，研究者已經(jīng)證實(shí)草甘膦能夠抑制Toxoplasmgondii、Cryptosporidium以及Plasmodiumfalciparum（malaria）等頂復(fù)門寄生蟲的生長(zhǎng)。
6.3EPSP合酶新型抑制劑草甘膦作為EPSP合酶的抑制劑是眾所周知的，但隨著EPSP合酶晶體與催化底物機(jī)理的深入研究，也推動(dòng)了EPSP合酶新型抑制劑的研發(fā)。如研究者根據(jù)S3P•glyphosate、EPSP合酶的分子模型，設(shè)計(jì)并合成了與除草劑草甘膦具有類似抑制作用的化合物4，用等溫低定量熱法測(cè)定EPSP合酶與化合物4的連接常數(shù)值Kd為0.53±0.04μmol/L，而EPSP合酶•S3P+glyphosate的Kd值為0.15±0.03μmol/L，前者Kd值僅僅是后者的3.5倍，而且通過動(dòng)力學(xué)、光譜學(xué)和微量熱法證實(shí)了化合物4與EPSP合酶的結(jié)合位點(diǎn)和S3P與酶的結(jié)合位點(diǎn)是相同的，從而抑制EPSP合酶的催化活性。研究者報(bào)道了莽草酸衍生物、羥基丙二酸衍生物等都可以與EPSP合酶形成四面體過渡態(tài)，從而使EPSP合酶活性受到抑制。目前，草甘膦依然是作用于該靶標(biāo)的有效抑制劑，還沒有新的EPSP合酶抑制劑商業(yè)化應(yīng)用，但隨著除草劑草甘膦的使用越來越廣，抗草甘膦雜草也越來越多，所以EPSP合酶新的抑制劑研究必將會(huì)成為熱點(diǎn)［74］。
6.4EPSP合酶對(duì)莽草酸代謝的影響莽草酸是生物體內(nèi)許多物質(zhì)合成代謝的中間體，也是人工化學(xué)合成許多生物堿、芳香氨基酸與吲哚衍生物、手性藥物（如抗病毒藥）的原料。近年來，禽流感爆發(fā)此起彼伏，危害人類健康安全。莽草酸是合成目前在臨床上唯一一種有效抗禽流感藥物——磷酸奧斯米韋（商品名為達(dá)菲，為瑞士Roche制藥公司生產(chǎn)）的關(guān)鍵原料，因此生物合成莽草酸的研究是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。EPSP合酶是莽草酸代謝下游的一個(gè)重要酶，研究表明，減弱或切斷該酶基因的表達(dá)或抑制其酶活性也有利于莽草酸的合成積累。Kramer等報(bào)道，敲除EPSP合酶基因，使莽草酸和莽草酸-3-磷酸大量累積，后者去磷酸化后就獲得目標(biāo)產(chǎn)物。2011年公布的美國專利“草甘膦在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)莽草酸中的使用”就是利用草甘膦對(duì)EPSP合酶的抑制作用來提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量。Bresnahan等研究報(bào)道，在給小麥?zhǔn)┘臃沁x擇性除草劑草甘膦后，不僅有助于農(nóng)作物的豐收，而且草甘膦還可以被吸收并轉(zhuǎn)移到植物的活性生長(zhǎng)區(qū)內(nèi)，通過抑制EPSP合酶的合成，能夠干擾莽草酸的正常代謝途徑。在試驗(yàn)中觀察到，在小麥乳熟期使用草甘膦會(huì)使其內(nèi)部的莽草酸最多增加24倍，若在蠟熟期使用，其內(nèi)部的莽草酸能增加3倍。
7結(jié)語
自EPSP合酶發(fā)現(xiàn)至今已有40多年，其理論與應(yīng)用研究都取得了顯著的成果。目前已發(fā)現(xiàn)并克隆出許多種EPSP合酶基因，特別在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，隨著許多耐草甘膦的EPSP合酶基因被克隆出來，有力的推動(dòng)了耐草甘膦作物的發(fā)展。雖然通過遺傳學(xué)方法改造EPSP合酶編碼基因，提高了生物對(duì)草甘膦的抗性，但是也降低了EPSP合酶的催化活性，所以目前改造成功并用于商業(yè)化生產(chǎn)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的基因幾乎全部是CP4-EPSP合酶基因，因此該領(lǐng)域有待進(jìn)一步深入研究。另一方面，EPSP合酶也可以作為抗菌素和抗寄生蟲藥物的靶標(biāo)。因此對(duì)EPSP合酶與草甘膦以及其它抑制劑的結(jié)合模式的研究，能夠?yàn)樵O(shè)計(jì)出新的除草劑、抗寄生蟲藥物以及抗菌素提供有力的理論依據(jù)。此外，EPSP合酶也是促進(jìn)生物體內(nèi)莽草酸積累的重要調(diào)控位點(diǎn)，因此隨著人們對(duì)EPSP合酶的全面深入研究，相信EPSP合酶基因會(huì)在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面發(fā)揮更重要的作用。雖然現(xiàn)在一些EPSP合酶的三維晶體結(jié)構(gòu)已通過物理化學(xué)方法和X-射線衍射得到，但是許多研究只報(bào)道了未與配體結(jié)合的EPSP合酶三級(jí)結(jié)構(gòu)，所以不能完全確定酶的活性位點(diǎn)，但隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，可利用計(jì)算機(jī)模擬出EPSP合酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)；另一方面通過計(jì)算機(jī)模擬，可為篩選出較高活性的EPSP合酶及抗草甘膦較強(qiáng)的EPSP合酶基因節(jié)省大量人力物力。本課題組首先利用分子對(duì)接軟件進(jìn)行反對(duì)接計(jì)算配體小分子化合物與不同生物的EPSP合酶結(jié)合自由能，同時(shí)根據(jù)計(jì)算結(jié)合自由能最低的結(jié)合模式分析底物、抑制劑（草甘膦）與EPSP合酶作用機(jī)理及其構(gòu)效關(guān)系，提出EPSP合酶基因的改造方案，應(yīng)用基因工程手段對(duì)目標(biāo)生物EPSP合酶基因進(jìn)行遺傳改造，改造選育出有利于莽草酸積累的生物突變體或耐草甘膦作物；另一方面根據(jù)底物、抑制劑（草甘膦）與EPSP合酶作用機(jī)理及其構(gòu)效關(guān)系，也可提出抑制劑改造方案，合成新的抑制劑備選化合物，通過試驗(yàn)驗(yàn)證最終篩選獲得更有效的除草劑、抗菌素或抗寄生蟲藥物。
作者：徐杰蔣世云傅鳳鳴耿鵬飛黃凱單位：廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院