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《食品科學(xué)雜志》2015年第二十四期

摘要：

為拓展乳酸菌生物膜在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，構(gòu)建可食用型高分子載體，本文以可介導(dǎo)乳酸菌粘附的氨基酸為配體，將其修飾在海藻酸鈉材料上，通過核磁、氨基酸含量、ζ電勢和水接觸角等檢測表征載體性質(zhì)，培養(yǎng)馬奶酒樣乳桿菌ZW3，研究載體對乳桿菌生長和胞外多糖分泌的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示：培養(yǎng)4d后，精氨酸修飾載體表面乳桿菌數(shù)量達(dá)到3.8×107CFU/cm2，是賴氨酸修飾載體的3.5倍；同時胞外多糖分泌量達(dá)到28.2μg/cm2，是賴氨酸修飾載體的2.4倍。與賴氨酸修飾載體相比，精氨酸修飾載體更有利于乳桿菌的生長和胞外多糖的分泌。該結(jié)果表明可以通過配體種類的選擇促進(jìn)乳酸菌生物膜的形成。

關(guān)鍵詞

氨基酸；海藻酸鈉；生物膜；乳酸菌；配體

細(xì)菌生物膜由于菌體間特殊的排列結(jié)構(gòu)和胞外聚合物的保護作用，能使細(xì)菌更好地生存和適應(yīng)環(huán)境。與游離狀態(tài)的細(xì)菌相比，生物膜具有良好的系統(tǒng)穩(wěn)定性和對一些不利環(huán)境的抗逆性[1]。乳酸菌作為有益菌中重要的一類，具有良好的發(fā)酵特性、食品保藏性能、營養(yǎng)價值和保健作用[2]。研究證明乳酸菌生物膜形式可提高發(fā)酵產(chǎn)率和體系穩(wěn)定性[3-4]，增加對不良因素的耐受性等[5-6]。如果能將乳酸菌以生物膜的形式添加到食品中，必將在改善人類健康方面發(fā)揮更大的作用[7]。為形成高效穩(wěn)定的乳酸菌生物膜，除培養(yǎng)條件的調(diào)控外，最重要的是載體性質(zhì)對生物膜形成的誘導(dǎo)作用。這是由于生物膜的形成起始于菌表面粘附素與材料表面的粘附，進(jìn)而分泌胞外聚合物將自身包繞其中而形成。然而，目前研究所使用的載體多為商業(yè)化產(chǎn)品，如玻璃、陶瓷片、不銹鋼和塑料[8-11]等。該類載體多為非可食用型材料，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)限制了乳酸菌生物膜在食品添加領(lǐng)域的應(yīng)用。一些小分子物質(zhì)可以介導(dǎo)乳酸菌的粘附，如單克隆抗體、抗生素和氨基酸[12-15]等。其中，氨基酸類配體生物相容性好，食用安全，結(jié)構(gòu)易于修飾，最重要的是不會對乳酸菌的活性造成負(fù)面影響。因此，本研究將氨基酸（如精氨酸、賴氨酸）修飾在天然高分子材料（如海藻酸鈉等）上，培養(yǎng)馬奶酒樣乳桿菌ZW3，考察生物膜形成情況。研究成果將為乳酸菌生物膜更廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑海藻酸鈉購于天津市博迪化工有限公司，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購于北京伊諾凱科技有限公司，精氨酸鹽酸鹽、賴氨酸鹽酸鹽和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）購于sigma。2-嗎啉乙磺酸（MES）、濃硫酸和噻唑藍(lán)（MTT）等試劑均為分析純。

1.1.2培養(yǎng)基改良MRS：乳糖4g，葡萄糖16g，酵母浸粉45g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳0.2g，氯化鈉0.1g，半胱氨酸鹽酸鹽1g，乙酸鈉15g，吐溫-801g，調(diào)節(jié)pH6.2，定容至1L，115℃高壓滅菌20min。

1.1.3菌種馬奶酒樣乳桿菌ZW3（LactobacilluskefiranofaciensZW3）分離自西藏靈菇，為本實驗自主分離、保藏菌種，保存于-80℃冰箱，改良MRS培養(yǎng)基30℃活化2代即可使用。

1.1.4儀器與設(shè)備MultiskanGO酶標(biāo)儀：芬蘭ThermoFisherScientific公司；AvanceIII核磁共振波普儀：德國Bruker公司；JY-82水接觸角儀：北京哈科試驗儀器廠；Mastersizer3000激光粒度儀：英國Malvern公司；SU-1510掃描電鏡：日本hitachi公司。

1.2方法

1.2.1氨基酸修飾海藻酸鈉的制備將250mg海藻酸鈉（Alg）溶解于50mLMES緩沖液（pH=6.5）中，冰水浴條件下加入125mgEDC和75mgNHS活化30min，加入300mg賴氨酸鹽酸鹽或250mg精氨酸鹽酸鹽，用1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至7.5，避光反應(yīng)24h。將反應(yīng)液對水透析72h，凍干，得到氨基酸修飾海藻酸鈉材料（Alg-Lys、Alg-Arg）。

1.2.2氨基酸修飾海藻酸鈉的表征Alg、Alg-Lys和Alg-Arg的材料結(jié)構(gòu)與組成通過核磁檢測（400MHz，D2O）；氨基酸含量通過水合茚三酮法測定，檢測波長570nm；將材料配成1mg/mL溶液，采用激光粒度儀測定ζ電勢。

1.2.3載體的固載將圓形蓋玻片（直徑=15mm）依次用無水乙醇、丙酮、雙蒸水超聲清洗10min，110℃烘干。將烘干的蓋玻片浸泡在50mL新鮮配置的食人魚溶液（H2O2:濃H2SO4=3:7）中，30min后用大量水洗至中性，110℃烘干冷至室溫。將蓋玻片浸入2%的APTES無水丙酮溶液中2h，依次用無水丙酮、乙醇、雙蒸水超聲清洗,烘干，冷卻至室溫待用。將1%（w/v）的Alg、Alg-Lys和Alg-Arg分別溶于MES緩沖液中，以1.2.1相同的方法進(jìn)行EDC、NHS活化，加入到蓋玻片上，反應(yīng)24h，用蒸餾水清洗，37℃烘干待用。

1.2.4載體表征固載有Alg、Alg-Lys和Alg-Arg載體的親疏水性通過靜態(tài)水接觸角儀測定，表征載體水接觸角。

1.2.5乳桿菌生物膜形成實驗將固載有Alg、Alg-Lys和Alg-Arg的載體放置在24孔板中，紫外照射滅菌；將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的馬奶酒樣乳桿菌ZW3以1%的接種率添加到新鮮的改良MRS培養(yǎng)基中[16]，1mL/孔接種到載體上，每2d更換新鮮的培養(yǎng)基，30℃厭氧培養(yǎng)2、3、4d后磷酸緩沖溶液（PBS）清洗，MTT染色，孵育4h后用DMSO溶解，酶標(biāo)儀490nm檢測吸光度。涂板計數(shù)活菌數(shù)量；將菌液梯度稀釋，以相同方法進(jìn)行MTT染色，以活菌數(shù)~吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算載體表面活菌數(shù)。

1.2.6生物膜胞外多糖含量檢測將厭氧培養(yǎng)至2、3、4d的生物膜用PBS清洗，每孔加入200μL蒸餾水、100μL6%苯酚溶液和500μL濃硫酸，靜止10min，25℃搖勻20min，酶標(biāo)儀490nm檢測吸光度，扣除胞內(nèi)多糖吸光度。以不同濃度葡萄糖溶液~吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算載體表面多糖含量。

1.2.7掃描電鏡觀察將培養(yǎng)至4d的生物膜用PBS清洗，加入2.5%戊二醛溶液固定30min，PBS清洗2次，室溫晾干，噴金，電鏡觀察形貌。

1.2.8數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)代表3次獨立實驗結(jié)果，以平均值±SD表示。統(tǒng)計分析采用Origin8.0軟件計算，以雙尾配對學(xué)生t檢驗比較顯著性差異，P<0.05代表具有顯著差異，P<0.01代表具有極顯著差異。

2結(jié)果與分析

2.1氨基酸修飾海藻酸鈉的制備及表征氨基酸修飾海藻酸鈉核磁對比譜圖如圖1所示，Alg核磁譜圖中3.5-4.0ppm為Alg糖環(huán)上氫的吸收峰，而Al-Arg和Alg-Lys譜圖中1.5-2.0、2.8-3.0ppm分別出現(xiàn)氨基酸上亞甲基氫的吸收峰[17]，說明材料合成成功。通過水合茚三酮法檢測制備材料的氨基酸含量，結(jié)果如表1所示：Alg中未發(fā)現(xiàn)含有氨基酸，而Alg-Arg和Alg-Lys中氨基酸含量均約為17%，含量接近。研究表明材料的表面電荷會對細(xì)菌粘附造成影響[18]。通過與Alg相比，發(fā)現(xiàn)Alg-Arg和Alg-Lys的ζ電勢均顯著提高，這是由于Arg和Lys均為堿性氨基酸，通常情況下容易帶正電荷。但Alg-Arg和Alg-Lys材料總體仍呈負(fù)電性，兩修飾材料電勢無明顯差異，可在同等水平上進(jìn)行載體固載。

2.2載體的固載及表征由于氨基酸修飾海藻酸鈉材料為水溶性材料，為便于研究，本文將其固載于玻璃載體上進(jìn)行后續(xù)性質(zhì)研究，反應(yīng)過程如圖2所示。除表面電荷，載體的親疏水性也會對細(xì)菌粘附造成影響[18]。因此，通過比較修飾載體的水接觸角發(fā)現(xiàn)（表2），Alg-Arg和Alg-Lys的水接觸角較Alg降低，這是由于Arg和Lys分別含有胍基和氨基等極性基團，均為親水性氨基酸。該結(jié)果說明材料固載成功，且兩者間無顯著差異，不會對細(xì)菌生物膜的形成產(chǎn)生影響。

2.3生物膜形成實驗馬奶酒樣乳桿菌ZW3為本組自主分離自西藏靈菇的的新菌種，其形成生物膜的性質(zhì)還未被研究。通過靜態(tài)厭氧培養(yǎng)，ZW3可在Alg-Arg和Alg-Lys載體表面粘附，并持續(xù)生長，而在Alg載體表面則無生長（如圖3所示）。培養(yǎng)2d后三種載體表面的活菌數(shù)量無顯著差異，這可能與ZW3菌生長周期較長（2d）有關(guān)。3d后Alg-Arg、Alg-Lys載體表面活菌數(shù)量顯著提高，以Alg-Arg載體最為突出，活菌數(shù)是Alg載體的2.3倍。而4d后，Alg載體表面活菌數(shù)量下降，這說明Alg載體可能不是乳桿菌ZW3生物膜形成的適宜載體。已有文獻(xiàn)報道親水性陰離子載體與某些細(xì)菌的結(jié)合能力較弱[19]；而Alg-Arg和Alg-Lys載體表面活菌數(shù)量持續(xù)上升，說明乳桿菌ZW3可能在載體表面形成了生物膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了菌體的生長。其生長趨勢與盧志山等報道的糞腸球菌生物膜菌體生長情況一致[20]。其中Alg-Arg的優(yōu)勢仍然最為明顯，活菌數(shù)是Alg載體的3.5倍，達(dá)到3.8×107CFU/cm2，也與王坤等報道的混菌不銹鋼網(wǎng)布密度相近[21]。圖3Jin[14]等曾報道Arg和Lys修飾的磁性納米粒子都能和革蘭氏陽性菌（芽孢桿菌）快速結(jié)合，10min內(nèi)可富集107CFU/mL。但本研究結(jié)果顯示Arg修飾載體在ZW3生物膜形成能力上明顯優(yōu)于Lys修飾載體。這可能是由于結(jié)合只是生物膜形成初期的關(guān)鍵一步[22]，表現(xiàn)為Alg-Arg和Alg-Lys載體表面早期（2d）菌體數(shù)量無顯著差異。而形成穩(wěn)定的生物膜還取決于多種因素（如胞外多糖、蛋白的分泌等）的共同影響，進(jìn)而導(dǎo)致后期（3-4d）產(chǎn)生顯著差異。為驗證這一推測，本研究又進(jìn)行了胞外多糖含量的測定。

2.4生物膜胞外多糖含量檢測ZW3本身具有良好的產(chǎn)胞外多糖特性[23]，其不溶性胞外多糖是生物膜的主要成分，在生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用，決定生物膜的結(jié)構(gòu)、細(xì)菌生長外環(huán)境等[24-25]。不同載體表面胞外多糖的分泌量如圖4所示，2d后Alg-Arg和Alg-Lys載體表面胞外多糖含量明顯高于Alg載體，這為兩載體表面活菌數(shù)量的增長奠定了基礎(chǔ)；3和4d后各載體表面胞外多糖含量趨勢與細(xì)菌量基本一致，很好地印證了胞外多糖對生物膜形成的作用。4d后Alg-Arg表面胞外多糖含量為Alg-Lys的2.4倍，這可能一定程度上解釋Arg修飾載體在ZW3生物膜形成能力上明顯優(yōu)于Lys修飾載體。

2.5掃描電鏡觀察Alg-Arg和Alg-Lys載體表面是否形成ZW3生物膜，可通過形貌觀察進(jìn)行判斷。如圖5所示，Alg載體表面乳桿菌數(shù)量稀少，且呈分散分布，未形成明顯的生物膜結(jié)構(gòu)，其結(jié)果與2.3、2.4相吻合；而Alg-Arg和Alg-Lys載體表面乳桿菌數(shù)量明顯增加，菌體緊密聚集，形成團塊狀結(jié)構(gòu)。可以看到菌體間有錯落的生物膜通道（圖5-B中箭頭所示），這是生物膜傳送營養(yǎng)和信息的重要結(jié)構(gòu)。菌體間片狀物質(zhì)可能主要為分泌的胞外物質(zhì)。

3結(jié)論

綜上所述，本文成功合成氨基酸修飾海藻酸鈉載體，并通過核磁、氨基酸含量、ζ電勢和水接觸角等表征載體性質(zhì)，在物理性質(zhì)基本一致的條件下比較Alg-Arg和Alg-Lys促進(jìn)乳酸菌生物膜形成的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Alg-Arg和Alg-Lys載體均可以促進(jìn)馬奶酒樣乳桿菌ZW3的生長，進(jìn)而分泌胞外多糖，形成生物膜。其中，Alg-Arg載體效果優(yōu)于Alg-Lys載體。因此，氨基酸修飾海藻酸鈉載體可作為一種食用性乳酸菌生物膜載體，應(yīng)用于食品領(lǐng)域。該研究表明可以通過配體種類的選擇促進(jìn)乳酸菌生物膜的形成。

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作者：孫也 王艷萍  李淑雅 劉兆賢 劉媛 單位：天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院