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摘要:為了考察實驗室對沙門菌的檢測能力，按照GB4789.4-2016和3M測試片兩種不同方法對能力驗證的盲樣進行檢驗，同時將盲樣與標準菌株做對照。經過預增菌、增菌、分離、生化試驗、血清學鑒定，兩個盲樣均得到滿意結果。2種方法均能夠準確地鑒定出沙門菌。通過這次能力驗證，實驗室的能力得到了有效的證明。

關鍵詞:沙門菌；國家標準；3M測試片；能力驗證；盲樣

沙門菌是最常見的食源性細菌病原體，是食物傳播病原菌中研究最多的一種病菌，也是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各國各類細菌性的食物中毒中，沙門菌常常位居前列。所以，沙門菌的檢測是各個國家檢驗機構對食品的必檢項目之一。檢測食源細菌的傳統方法是對目標菌進行培養、分離和生化鑒定，有時還需要進行血清學鑒定，繁瑣耗時。因此快速、準確地檢驗微生物的新技術、新方法不斷出現，可提高食品微生物檢驗工作的高效性、準確性和可靠性。通過參加能力驗證活動，能夠發現實驗室存在的問題，幫助實驗室不斷改善技術和管理水平，同時還能增加客戶對實驗室的信任程度[1]。為了提高實驗室的檢測能力和水平，本實驗室參加了由原遼寧出入境檢驗檢疫局組織的沙門菌檢測能力驗證。此次能力驗證樣品2個、標準菌株1個、樣品4個、樣品加標準菌株的菌懸液2個，共9個樣品采用國標GB4789.4-2016《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗方法》[2]和3M測試片法，2種方法對測試樣品進行檢測分析，取得滿意結果。

1材料與方法

1.1材料沙門菌樣品

（凍干粉），由原遼寧出入境檢驗檢疫局提供；鼠傷寒沙門菌（ATCC14028）3M測試片，購于北京陸橋技術有限責任公司；4種口味的壓縮干糧，由軍代室提供。

1.2培養基和試劑緩沖

蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂、沙門菌顯色培養基、沙門菌干制生化鑒定試劑盒，購于北京陸橋技術有限責任公司。沙門菌屬O多價血清A-F，購于寧波天潤生物藥業有限公司。

1.3儀器與設備

BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜（濟南鑫貝西生物技術有限公司）；AV8101精密天平（美國SpiralBiotech公司）；400VW均質器（法國Interscience公司）；LRH-250生化培養箱（上海一恒科技有限公司）；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

2樣品制備

2.1樣品原液的制備

無菌開啟西林瓶，立即加入少量（2～4mL）稀釋液（生理鹽水）進行再水化，稀釋液合計40mL，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復用余下的稀釋液清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述的無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液，全過程20min內完成[3]。

2.2菌懸液的制備

以無菌生理鹽水將鼠傷寒沙門菌制成菌懸液，于36℃±1℃，18～24h增菌培養后備用。

3檢驗方法及結果

采用GB4789.4-2016和3M測試片2種方法進行檢測。其中3M測試片只做前增菌的步驟。同時2種方法均利用標準菌株作對照。

3.1預增菌

（1）以無菌操作吸取水化后的樣品原液25mL，加入裝有225mL滅菌BPW的無菌錐形瓶，震蕩搖勻。（2）固體樣品粉碎后稱取25g，加入滅菌225mLBPW的無菌均質袋中，用均質器拍打1～2min。（3）20g粉碎固體樣品和5mL菌懸液后加入滅菌225mLBPW的無菌錐形瓶，用均質器拍打1～2min。于36℃±1℃，培養8～18h。

3.2增菌

取預增菌后的BPW緩沖液中分別移取1mL轉接種于10mLTTB內，于42℃±1℃培養18～24h；移取1mL轉接種于10mLSC內，于36℃±1℃培養18～24h。用無菌吸管吸取1mL能力驗證樣品、樣液和樣品加菌懸液的勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置10s左右；同時做菌株的勻液。于36℃±1℃，培養15～24h。結果：沙門菌在3M測試片上的結果應為綠色菌落。（1）菌株在3M測試片上的結果為綠色菌落。（2）能力驗證樣品1在3M測試片上的結果為黃色菌落。（3）能力驗證樣品2在3M測試片上的結果為綠色菌落。（4）樣品1在3M測試片上的結果為黃色菌落。（5）樣品2在3M測試片上的結果為黃色菌落。（6）樣品3在3M測試片上的結果為黃色菌落。（7）樣品4在3M測試片上的結果為黃色菌落。（8）樣品加菌懸液1在3M測試片上的結果為綠色菌落。（9）樣品加菌懸液2在3M測試片上的結果為綠色菌落。

3.3分離

取增菌后的沙門菌增菌液分別接種在沙門菌顯色培養基、XLD瓊脂平板于36℃±1℃，培養18～24h。BS瓊脂平板上，于36℃±1℃，培養40～48h。觀察各個平板上生長的菌落形態，詳見表1。通過觀察可以確定沙門菌顯色培養基生長的白色和藍綠色菌落、BS瓊脂平板上白色的菌落為非典型菌落，不符合標準菌株的菌落形態可以排除。沙門菌顯色培養基上的紫色菌落為A菌，XLD瓊脂平板上的能力驗證樣品1上和樣品1～4上為黃色菌落為B菌，黑色菌為C菌，能力驗證樣品2上的菌落形態是黑色有光澤和黃色為D和E菌，BS瓊脂上灰黑色無光澤為F菌，灰綠色帶有黑心為G菌，黑色有金屬光澤為H菌。一共8種菌落為可疑菌，需進行生化試驗和血清學鑒定。

3.4生化鑒定套裝試驗結果

（1）分別從沙門菌顯色培養基、XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上挑取A到H共8種菌落及標準菌株分別接種在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基上，于36℃±1℃，培養18～24h，觀察結果，詳見表2。通過在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基生化試驗比較發現，XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上的B、C、F3種菌落生化反應均不符合沙門菌的生化特征，標準菌株符合沙門菌的生化特性。（2）生化鑒定套裝試驗：分別從沙門菌顯色培養基、XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上挑取A、D、E、G、H共5種分別接種到沙門菌干制生化鑒定試劑套裝中的試劑中，于36℃±1℃，培養18～24h，觀察結果詳見表3。通過生化試驗比較發現，XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板上的A、D、E、G、H5種菌落生化反應均符合沙門菌的生化特征，標準菌株符合沙門菌的生化特性。

3.5血清學鑒定先檢查待測菌有無自凝現象。

經檢查兩種可疑菌均未發生自凝的現象。在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區域，挑取一環待測菌，各放1/2環于玻片上的每一區域上部，在右邊區域加1滴沙門菌屬O多價血清A-F，在左邊區域加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環將兩個區域內的菌落研成乳狀液[2]。將玻片傾斜搖動混合1min，并對著黑色背景進行觀察，可疑菌A、D、E、G、H均發生凝集反應，血清學實驗為陽性，B、C、F可疑菌均未發生凝集反應，血清學實驗為陰性。標準菌株發生凝集反應，血清學實驗為陽性。

4結論

利用2種方法檢測能力驗證樣品1均未檢出沙門菌，能力樣品2均檢出沙門菌，結果為滿意。樣品1～4未檢出沙門菌、菌懸液加樣品1和樣品2有效的檢出沙門菌。3M測試片的方法無需特定的儀器設備，且操作簡單、快速出結果、靈敏度高、易于判斷；該方法已獲得AOAC官方方法認證，其結果準確可靠，適合應用于廣大食品企業和政府實驗室沙門菌的檢測[4]。國標法是經典的檢測方法，但檢測周期長，過程復雜[5]。3M測試片方法檢測能夠快速準確的檢測出結果。2種方法結合，綜合判斷，可確保檢測結果的準確性。通過這次能力驗證，提高了實驗室的檢測能力，積累經驗的同時在試驗中發現了很多不足：（1）3M測試片法中由于實驗室很少做，因為不知能力驗證樣品中添加的沙門菌的濃度，直接使用前增菌液，導致測試片上沒有單個菌落生長，最好使用增菌后的的液體。或者使用3M測試片法測定沙門菌配套的試劑。（2）沙門菌分離純化可疑菌的時候，需要多次純化，本次實驗只挑取了選擇瓊脂上的可疑菌落，以后實驗中出現可疑菌的時候應在營養瓊脂純化后再進行生化試驗。（3）血清學鑒定的時候兩種診斷血清都應該做，然而實驗室只做了沙門菌屬O多價的，盲樣未凝集故實驗室沒做抗原H的鑒定，在以后的試驗過程中如果O多價凝集后必須再做抗原H的鑒定。

參考文獻

[1]李晶，黃鴻新，鄭燕.能力驗證對提升實驗室檢測能力的作用[J].臨床醫學工程，2010，17（2）：121-122.

[2]GB4789.4-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗[S].

[3]陳蕊君，馬秀玲，徐騰月.食品中志賀氏菌的檢測能力驗證結果分析[J].解放軍預防醫學，2015，33（4）：372-374.

[4]陳露露，方柯.3MPetrifilmTM沙門氏菌快速測試片法效果評價[J].食品工業，2016，37（3）：118-120.

[5]張艷超，史永剛，衛佳歡，等.3種方法檢測食品中沙門菌能力驗證結果分析.[J].檢驗檢疫學刊，2016，26（3）：14-17.

作者：徐騰月 任霞 單位：中國人民解放軍食品檢測試驗中心