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《應(yīng)用昆蟲學(xué)報》2016年第二期

摘要

【目的】闡明小菜蛾Plutellaxylostella(L.)對乙基多殺菌素的代謝抗性機理，為延緩小菜蛾對乙基多殺菌素抗藥性發(fā)展及抗性治理技術(shù)提供支持。【方法】通過酶動力學(xué)方法測定了小菜蛾對乙基多殺菌素高抗、中抗和敏感種群的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和多功能氧化酶4種代謝解毒酶的比活力。【結(jié)果】乙基多殺菌素高抗小菜蛾種群的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶的比活力分別為15.38、3.15和7.30OD•min-1•mg-1pro，顯著高于敏感種群；但乙酰膽堿酯酶在中抗種群和敏感種群中比活力差異不顯著；多功能氧化酶在高抗、中抗和敏感種群中的比活力分別為4.97、4.08和4.23OD•min-1•mg-1pro，差異不顯著。【結(jié)論】谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶的酶活隨著小菜蛾對乙基多殺菌素抗性的增強而增強，而多功能氧化酶的酶活在抗性種群與敏感種群間差異不顯著，因此小菜蛾對乙基多殺菌素的代謝抗性機理研究應(yīng)重點關(guān)注這3種酶。

關(guān)鍵詞

小菜蛾，酶活性，乙基多殺菌素，抗藥性

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)屬鱗翅目菜蛾科，是十字花科作物重要害蟲，嚴(yán)重威脅十字花科蔬菜生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，一般年份小菜蛾危害可使蔬菜損失達(dá)30%～50%，嚴(yán)重時可減產(chǎn)90%以上，甚至絕收，每年給世界造成經(jīng)濟損失4～5億美元（Furlongetal.，2013）。由于其自身的生理生化特性，小菜蛾幾乎對現(xiàn)有殺蟲劑均產(chǎn)生了抗性（Zhaoetal.，2006）。乙基多殺菌素Spinetoram是一個新型高效的廣譜性農(nóng)用抗生素，作用于昆蟲的煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）和γ-氨基丁酸（GAGB），受體具有殺蟲速度快、持效期長、對有益生物如蜜蜂等影響極小等優(yōu)點，屬新型環(huán)境友好型生物農(nóng)藥，成為目前防控小菜蛾的首選藥劑（華乃震，2015）。隨著乙基多殺菌素的大面積推廣應(yīng)用，小菜蛾對該藥劑抗藥性的發(fā)展成為關(guān)注焦點。昆蟲的生理/生化抗性在昆蟲對殺蟲劑抗藥性的產(chǎn)生與發(fā)展過程中起著主要作用。生理/生化抗性主要包括靶標(biāo)抗性和代謝抗性兩種機制。在靶標(biāo)抗性和代謝抗性等多種昆蟲的抗藥性機制中，昆蟲體內(nèi)酶代謝能力增強所導(dǎo)致的是昆蟲對殺蟲藥劑產(chǎn)生抗性的重要機制之一（邢劍飛等，2010）。昆蟲體內(nèi)的羧酸酯酶（CarE）、乙酰膽堿酯酶（AchE）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）以及多功能氧化酶（MFO）等代謝解毒酶酶活的提高及變化是導(dǎo)致昆蟲抗藥性產(chǎn)生的主要原因之一。本文通過對乙基多殺菌素高抗、中抗和敏感小菜蛾種群3齡幼蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和多功能氧化酶4種酶進行活性測定，比較小菜蛾乙基多殺菌素不同抗性種群代謝解毒酶酶活的變化，為研究小菜蛾對乙基多殺菌素抗藥性機理提供依據(jù)，對小菜蛾抗性治理技術(shù)的研究和應(yīng)用具有積極作用。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx小菜蛾敏感品系：2002年7月采集于廣東廣州，在室內(nèi)不接觸任何藥劑的條件下連續(xù)飼養(yǎng)至今。小菜蛾抗性品系：中抗種群2014年3月采集于廣東廣州石井菜田；高抗種群由中抗種群通過乙基多殺菌素汰選獲得。

1.2供試藥劑乙基多殺菌素（60克/升懸浮劑）：陶氏益農(nóng)，α-乙酸萘酯（廣州齊云生物技術(shù)有限公司，化學(xué)純），固藍(lán)RR（上海華藍(lán)科技有限分司），碘化硫代乙酰膽堿（SigmaAldrich），對硝基苯甲醚（p-NA）（瑞士Adamas-beta公司，分析純），2，3-二氯硝基苯（DCNB）（揚中市天力化工有限公司）還原型輔酶Ⅱ（NADPH）（Roche，進口分裝），牛血清白蛋白和考馬斯亮藍(lán)G250（上海藍(lán)季科技發(fā)展公司），其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3生物測定方法采用葉片藥膜法（Zhaoetal.，2002）。用潔凈甘藍(lán)Brassicaoleracea，剪成直徑6.5cm圓片（避免主葉脈）。將葉片在藥液中浸泡10s后取出晾干（25℃，2h），置于直徑6.5cm培養(yǎng)皿中，接入10頭3齡初幼蟲，覆蓋雙層吸水卷紙，蓋上培養(yǎng)皿上蓋。將其正面向上置于溫度（25±1）℃，相對濕度65%~70%，光照比（16L∶8D）的培養(yǎng)箱中。每處理4次重復(fù)。48h后檢查死亡率，計算毒力回歸方程、LC50值及其置信區(qū)間。小毛筆或尖銳鑷子輕觸蟲體，蟲體沒有反應(yīng)或不能協(xié)調(diào)運動視為死亡。

1.4酶源制備將5頭3齡幼蟲末小菜蛾幼蟲置于玻璃勻漿器底部，加入1mL0.2mol/LpH6.0磷酸緩沖液（羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）、0.1molpH7.5磷酸緩沖液（含0.1%Triton-100）（乙酰膽堿酯酶）、0.1mol/LpH7.5磷酸緩沖液（含1mmol/LEDTA、0.1mmol/LDTT、1mmol/LPTU，1mmol/LPMSF）(多功能氧化酶)，置于冰上研磨勻漿，完成后，吸取200L勻漿液轉(zhuǎn)入至1.5mL離心管內(nèi)，加入200LPBS緩沖液，在4℃下，12000r/min離心5min，收集上清液即為酶源。

1.5解毒酶活性測定多功能氧化酶活性參照Qian等（2008）方法。取2mol/LPNA125L，9.6mmol/LNADPH12.5L，酶源112.5L，共250L為反應(yīng)體系，34℃，水浴30min，取200L加入酶標(biāo)孔，405nm讀數(shù)，結(jié)果為生成的對硝基苯酚量計算。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性測定參照Zhu等（2000）。取100L酶源，100L1.2mmol/LCDNB，100L12mmol/LGSH分別加入酶標(biāo)板孔中輕輕混勻，避免氣泡產(chǎn)生。保證終濃度為0.4mmol/L，GSH終濃度為4mmol/L，對照則以100L0.2mol/LpH6.0磷酸緩沖液代替酶源參加反應(yīng)。在340nm下反應(yīng)5min，每隔10s記錄一次光密度值。羧酸酯酶活性測定參照Han等（1998）。取酶源50L，置于96孔酶標(biāo)板，迅速加入200L0.5g/L的固藍(lán)RR鹽和1mmol/Lα-乙酸萘酯，450nm下反應(yīng)10min，每隔12s記錄一次光密度值。乙酰膽堿酯酶活性測定參照Byrne和Devonshire（1993）的研究方法。取50L酶源、50L0.1mol/LPBS(pH7.5)、100L0.75mmol/L碘化硫代乙酰膽堿和100L0.05mmol/L的硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）加入96孔酶標(biāo)板，反應(yīng)總體積為300L。在405nm下每隔30s記錄一次光密度值，共記錄30次。

1.6蛋白含量測定參照Bradford（1976）考馬斯亮藍(lán)G-250方法。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用DPSv8.01數(shù)據(jù)處理軟件的Duncan氏新復(fù)極差測驗法進行差異顯著性分析（唐啟義和馮明光，2007）。

2結(jié)果與分析

2.1不同品系小菜蛾室內(nèi)毒力測定結(jié)果以10g/mL篩選獲得小菜蛾對乙基多殺菌素高抗種群，并對該種群進行了室內(nèi)毒測定，測定結(jié)果表明，該種群對乙基多殺菌素的致死中濃度達(dá)11.12mg/L，是敏感種群的556倍，根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T2360-2013，其抗性達(dá)高水平抗性，如表1所示。

2.2谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性隨著小菜蛾對乙基多殺菌素抗性水平的提高而增強。其中，中抗種群的酶活為13.67OD•min-1•mg-1pro，與敏感種群的比值為1.8；高抗種群的酶活為15.38，是敏感種群的2.02倍，如表2所示。

2.3羧酸酯酶活性如表3所示，對乙基多殺菌高抗的小菜蛾體內(nèi)羧酸酯酶活性略高于對乙基多殺菌素中抗的小菜蛾體內(nèi)羧酸酯酶活性。兩者差異不顯著。但與敏感種群相比，中抗和高抗品系小菜蛾體內(nèi)羧酸酯酶活性顯著高于敏感品系小菜蛾體內(nèi)羧酸酯酶活性。

2.4乙酰膽堿酯酶活性當(dāng)小菜蛾對乙基多殺菌素的抗性達(dá)到556倍的高抗水平時，其乙酰膽堿酯酶的活性提高，達(dá)到敏感種群的1.65倍，如表4所示。但在中等抗性小菜蛾種群中，乙酰膽堿酯酶活性與敏感種群的并沒有顯著差異。

2.5多功能氧化酶活性小菜蛾多功能氧化酶的活性并不隨著對乙基多殺菌素抗性水平的變化而變化。如表5所示，高抗種群小菜蛾的多功能氧化酶活性雖然略高于敏感種群和中抗種群的，但三者之間并沒有顯著差異。

3討論

當(dāng)昆蟲受到外界刺激時，其體內(nèi)活性酶會迅速做出反應(yīng)，從而存活下來（唐振華和畢強，2003）。昆蟲抗藥性與其體內(nèi)靶標(biāo)酶（如乙酰膽堿酯酶）的敏感性下降以及多功能氧化酶(MFO)、谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶和特異性酯酶的活性增強有關(guān)（陳之浩等，1992；吳剛等，2002；羅雁婕等，2008）。羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶是昆蟲體內(nèi)的一種水解酶系，二者含量的升高均會導(dǎo)致昆蟲抗性的升高（邢劍飛等，2010）。羧酸酯酶主要通過代謝、分解體內(nèi)某些內(nèi)源或外源的有毒物質(zhì)，將其排出體外來保護機體的正常機能。其在昆蟲降解殺蟲劑方面扮演著重要的角色（郭麗和沈孝兵，2004；Holmesetal.，2008）。羧酸酯酶活力增加是棉蚜AphisgossypiiGlover，桃蚜Myzuspersicae，東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis（Meyen）對有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的原因（Caoetal.，2008；Panetal.，2009；Zhangetal.，2011）；棉蚜對溴氰菊酯的抗性是由于羧酸酯酶的不敏感性降低而引起的（趙善歡，2001）；阿維菌素類殺蟲劑的抗性產(chǎn)生與羧酸酯酶的活性增強有關(guān)（吳青君等，2001）。王光峰等（2003）研究表明多殺菌素在活體條件下能夠誘導(dǎo)甜菜夜蛾體內(nèi)羧酸酯酶活性的增強。本研究結(jié)果表明抗乙基多殺菌素小菜蛾的羧酸酯酶活性明顯高于敏感種群小菜蛾，這說明小菜蛾對乙基多殺菌素的抗藥性與羧酸酯酶活性的增加有關(guān)。

乙酰膽堿酯酶通過快速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿而中止神經(jīng)沖動的傳遞，其對殺蟲劑敏感性降低是昆蟲產(chǎn)生抗性的一個重要原因（孟琳琳等，2010）。本研究表明，在高抗小菜蛾體內(nèi)乙酰膽堿酯酶比活力顯著高于敏感品系，而中抗小菜蛾體內(nèi)乙酰膽堿酯酶較高抗品系略低，說明乙基多殺菌素對小菜蛾體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響隨著抗性的變化而變化，其具體變化機制有待進一步研究。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是一種昆蟲體內(nèi)與抗性有關(guān)的初級代謝及次級代謝酶系，其解毒作用是催化谷胱甘肽的軛合，形成一個能夠被排泄出的產(chǎn)物；與底物形成一個非共價鍵，由此作為一個攜帶蛋白質(zhì)，把底物帶到一個可以代謝或排泄的部位；即形成一個共價鍵，使底物與酶都失去活性（陳秀華等，2013）。尹顯慧等（2008）年研究表明，多殺菌素對小菜蛾谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶具有誘導(dǎo)作用。小菜蛾體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的高活力是小菜蛾對有機磷類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的重要機制之一（吳剛等，2000；呂敏等，2003）。以上研究與本研究結(jié)果一致，乙基多殺菌素誘導(dǎo)小菜蛾體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，抗性小菜蛾種群中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性顯著高于敏感種群。多功能氧化酶在小菜蛾對阿維菌素的抗性中起著重要的作用（梁沛等，2001；黃劍，2005）。但本研究表明，抗性品系小菜蛾與敏感品系小菜蛾相比，其體內(nèi)多功能氧化酶活性差異不顯著，說明小菜蛾對乙基多殺菌素的抗藥性與些酶無關(guān)。小菜蛾對乙基多殺菌素的抗藥性是一個復(fù)雜的過程，本研究結(jié)果為乙基多殺菌素對小菜蛾的作用機理研究提供一定的理論基礎(chǔ)，但其具體的作用方式需要進一步從基因水平加以驗證。

作者：尹飛 陳煥瑜 馮夏 胡珍娣 林慶勝 李振宇 包華理 單位：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室