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《中國(guó)糧油學(xué)報(bào)》2016年第三期

摘要

采用亞臨界丁烷對(duì)大豆粉脫油制得豆粕(DSF－B)，并與正己烷制備豆粕(DSF－H)比較，對(duì)分離蛋白得率及熱變性、豆粕殘余極性脂和在貯藏過(guò)程中蛋白的氧化進(jìn)行分析。DSF－B的蛋白得率(32．1%)比DSF－H高(約6%)，蛋白熱變性二者一致，且11S變性溫度低于工業(yè)白豆片。殘余極性脂分析，DSF－B比DSF－H總量低、磷脂含量高，脂肪酸組成有差異。模擬貯藏試驗(yàn)表明，DSF－B在貯藏中蛋白更易被氧化，這可能與極性脂的組成有關(guān)。亞臨界萃取技術(shù)無(wú)高溫處理、可選溶劑多樣，可開(kāi)發(fā)應(yīng)用于大豆等植物蛋白制品。

關(guān)鍵詞

亞臨界丁烷；正己烷；豆粕；蛋白氧化

豆粕是大豆提取豆油后的副產(chǎn)品。它含有45%左右的蛋白質(zhì)，氨基酸種類(lèi)齊全，除蛋氨酸含量較低外，其余必需氨基酸含量均比較豐富，且含有大豆磷脂、大豆異黃酮等生物活性物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。作為優(yōu)質(zhì)植物蛋白原料，豆粕被廣泛應(yīng)用于畜禽飼料和商用脫脂大豆蛋白產(chǎn)品。但豆粕在生產(chǎn)及貯藏過(guò)程中，受加工方式、外部環(huán)境及水分、脂質(zhì)、酶等因素影響，質(zhì)量發(fā)生劣變，蛋白隨之受到誘導(dǎo)變性，蛋白氧化是主要形式之一，嚴(yán)重降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。亞臨界萃取技術(shù)是近20年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的萃取分離技術(shù)［1］。在萃取過(guò)程中，萃取劑溫度高于其沸點(diǎn)、始終為液態(tài)，利用相似相溶原理，萃取生物原料中的脂類(lèi)物質(zhì)。它的主要優(yōu)點(diǎn)是低溫工藝，不會(huì)對(duì)熱敏性成分造成損害，目前已在精油、色素、植物油、藥材等幾十種植物原料脂溶性和水溶性成分的分離提取中得到應(yīng)用［2］。同時(shí)，有研究報(bào)道植物油料應(yīng)用亞臨界丙烷和丁烷萃取工藝，保證了粕中植物蛋白等成分不變性［3］。以大豆為代表的食用油生產(chǎn)中，國(guó)內(nèi)外大多采用正己烷作為浸出溶劑，工藝中的熱處理會(huì)破壞油料中的有用成分，并且正己烷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有一定的毒性，人們已提出質(zhì)疑并期望找到可替代溶劑。對(duì)亞臨界萃取技術(shù)的研究，目前主要集中在油脂、天然活性物質(zhì)等有關(guān)成分的分離提取方面，對(duì)粕和蛋白的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用亞臨界丁烷萃取技術(shù)制備豆粕，并與傳統(tǒng)的正己烷制備豆粕進(jìn)行比較，分析分離蛋白得率及熱變性、豆粕殘余極性脂和在貯藏過(guò)程中蛋白的氧化變性，以期為亞臨界萃取技術(shù)中副產(chǎn)品的綜合利用提供理論參考。

1材料與方法

1．1材料與設(shè)備大豆和白豆片，市售;亞臨界丁烷:廣州深巖燃?xì)庥邢薰?其他試劑為分析純或色譜純。亞臨界流體萃取裝置:珠海共同機(jī)械有限公司;DYF－500搖擺式高壓萬(wàn)能粉碎機(jī):溫嶺市林大機(jī)械有限公司;KDN－102C定氮儀:上海纖檢儀器有限公司;CR22G高速冷凍離心機(jī):日本Hitachi公司;Alpha－4冷凍干燥機(jī):德國(guó)Christ公司;SevenE-asypH計(jì):梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;UV2300紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì):上海天美科學(xué)儀器有限公司;Nano示差掃描量熱儀:美國(guó)TA公司;GC5890－MS5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國(guó)安捷倫公司。

1．2試驗(yàn)方法

1．2．1脫脂豆粕的制備亞臨界丁烷萃取:大豆經(jīng)清理除雜、粉碎，過(guò)30目篩，萃取壓力0．4MPa、溫度40℃、時(shí)間30min，重復(fù)3次。然后鋪成薄層置于通風(fēng)廚，并定期翻動(dòng)，干燥24h粉粹過(guò)60目篩。正己烷浸提:大豆經(jīng)清理除雜、粉碎，過(guò)60目篩，加入4倍體積正己烷浸提脫脂，溫度40℃、時(shí)間30min，重復(fù)3次。然后鋪成薄層置于通風(fēng)廚，并定期翻動(dòng)，干燥24h過(guò)60目篩。

1．2．2分離蛋白的制備脫脂豆粕經(jīng)堿溶酸沉提取蛋白，采用Zheng等［4］的方法。蛋白得率=(提取的蛋白干重/脫脂豆粕干重)×100%。蛋白回收率=(提取的蛋白干重×蛋白含量)/(脫脂豆粕干重×豆粕蛋白含量)×100%。

1．2．3豆粕主要指標(biāo)測(cè)定蛋白含量:參考GB/T5009．5—2003，微量凱氏定氮法［5］。蛋白含量=含氮量×6．25。極性脂含量:參考GB/T2677．6—1994［6］，用索氏抽提法測(cè)定極性脂含量，抽提溶劑為氯仿－甲醇(2∶1，V/V)。極性脂含量(干基)=(極性脂質(zhì)量/試樣干重)×100%。

1．2．4分離蛋白熱變性測(cè)定采用Meng等［7］的差示掃描熱量法(DSC)。將約2mg樣品和10μL、50mmol/L、pH7．0的磷酸緩沖液密封于鋁盤(pán)中，以空白鋁盤(pán)作對(duì)照，將樣品以10℃/min加熱速率由20℃加熱至120℃。

1．2．5豆粕殘余極性脂分析殘余極性脂提取:稱(chēng)取豆粕3g，加入15mL氯仿－甲醇(2∶1，V/V)，室溫?cái)嚢栎腿?0min，10400r/min離心10min取上清液備用，測(cè)脂肪酸和磷脂組成。氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS):取適量上清液，氮吹除去溶劑，采用GB/T17376—2008［8］酯交換法進(jìn)行甲酯化。氣相色譜條件:色譜柱HP－5MS(30m×0．25mm×0．5μm)，進(jìn)樣口溫度250℃，載氣流速(He)1．0mL/min，進(jìn)樣量2．0μL，分流比50∶1。采用程序升溫，柱初溫100℃，以10℃/min升溫至280℃，保持10min。離子源EI70ev，掃描范圍50～450amu。用面積歸一化法確定各成分的相對(duì)含量。薄層層析(TLC):取上清液20μL點(diǎn)到硅膠H薄層板上，用氯仿/甲醇/冰醋酸/水(85∶15∶10∶3，V/V)混合液展開(kāi)，取出，晾干，碘蒸氣顯色。

1．2．6模擬貯藏豆粕2種豆粕各取適量，均分為2份。各取1份100℃干熱處理20min。將4份豆粕(干熱處理與未處理各2份)鋪成薄層置于35℃密閉水浴鍋吸收水分2h，提高含水量。將上述豆粕放入密封瓶中，置于60℃烘箱存放，分別于第1、2、4、6天取樣，4℃保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行一次重復(fù)試驗(yàn)。

1．2．7豆粕蛋白的氧化指標(biāo)測(cè)定溶解度:精確稱(chēng)取0．02g樣品于消化管，參考GB/T5009．5—2003微量凱氏定氮法［5］測(cè)定總氮含量;再精確稱(chēng)取0．35g樣品于20mL去離子水中，室溫下攪拌溶解1．5h，以10000r/min離心20min，取上清蛋白液5mL于消化管，沸水浴濃縮至稠狀物，按微量凱氏定氮法［5］測(cè)定可溶性氮含量。蛋白含量=含氮量×6．25。溶解度=(上清液中的蛋白含量/樣品蛋白含量)×100%羰基含量:取上述測(cè)溶解度的上清蛋白液，根據(jù)Huang等［9］的方法測(cè)定羰基含量。以上清液中每g蛋白所含μmol計(jì)。自由巰基含量:精確稱(chēng)取0．35g樣品，加入20mL、0．1mol/L、pH8．0磷酸緩沖液，該磷酸緩沖液含有l(wèi)mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)和1%SDS(十二烷基硫酸鈉)，室溫下攪拌溶解1h。以10000r/min離心20min，取上清蛋白液。根據(jù)Huang等［9］的方法測(cè)定自由巰基。以每g豆粕蛋白所含μmol計(jì)。

1．3數(shù)據(jù)分析利用SPSS11．7和OriginPro8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示，顯著水平為P＜0．05。

2結(jié)果與討論

2．1豆粕主要成分如表1所示，以市售WF作參照，DSF－B與DSF－H的蛋白含量和極性脂含量與之相近。DSF－B的極性脂含量比DSF－H略低，殘余極性脂是影響豆粕品質(zhì)和引起蛋白氧化變性的主要因素。

2．2蛋白質(zhì)得率和回收率蛋白得率的高低與生產(chǎn)大豆蛋白企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益直接相關(guān)，其變化范圍一般為20%～30%［10］，DSF－B蛋白得率為32．1%，比DSF－H高(約6%)。二者蛋白含量接近，故DSF－B的蛋白回收率相應(yīng)比DSF－H高(圖1)。

2．3分離蛋白的熱變性圖2顯示3種蛋白的7S和11S組分都有明顯的特征吸收峰，說(shuō)明蛋白變性程度低。表2列出了11S組分變性的起始溫度(Tm)、峰值溫度(Td)及焓變(ΔH)，可知SPI－B與SPI－H的11S組分變性溫度比WFSPI低。由于DSF－B與DSF－H采用自然干燥脫溶，全部處理溫度最高僅為40℃，而市售WF目前常采用閃蒸脫溶和臥式脫溶，有不同時(shí)間的高溫處理(閃蒸脫溶約2s，臥式脫溶10～15min)［11］，蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，使其熱變性需要更高溫度，所以可能導(dǎo)致SPI－B與SPI－H的11S組分變性溫度比WFSPI低，具有較差的熱穩(wěn)定性。

2．4豆粕殘余極性脂分析棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸是大豆中含量最多的5種脂肪酸，占出峰物質(zhì)的99%以上［12］。從表3可見(jiàn)，脂肪酸含量高低順序均依次為亞油酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸、亞麻酸，但其相對(duì)含量有一定的差異。DSF－B的亞油酸和亞麻酸相對(duì)含量比DSF－H略高，而油酸含量明顯低于DSF－H。大豆中豐富的脂肪氧合酶能催化含1，4－順，順－戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸)，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的自由基、脂質(zhì)氫過(guò)氧化物及活性醛類(lèi)會(huì)使蛋白發(fā)生共價(jià)修飾，造成蛋白氧化［13］。殘余極性脂含量DSF－B為3．90%，DSF－H為4．38%(見(jiàn)表1)。TLC分析表明(見(jiàn)圖4)，2種豆粕含有磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂(PC)，磷酯酰肌醇(PI)等磷脂，磷脂的含量和組成不同。圖4可知，L是商業(yè)卵磷脂，從上至下3個(gè)主要組分依次為PE、PC、PI［14］，可以看出DSF－B中磷脂含量較高，主要表現(xiàn)在PC較多。這是因?yàn)椋⊥楸日和閷?duì)磷脂的浸出量少，DSF－B殘余的磷脂相應(yīng)多。

2．5貯藏過(guò)程中蛋白的氧化評(píng)價(jià)豆粕在貯藏過(guò)程中，水分、殘余脂質(zhì)、脂肪氧合酶等將導(dǎo)致其質(zhì)量劣變，蛋白氧化隨之發(fā)生。脂肪氧合酶在60℃左右有一個(gè)激活態(tài)，酶被激發(fā)出更高的活力［15］。試驗(yàn)中為了較快分析豆粕在貯藏中蛋白的變化，貯藏前使豆粕吸收水分成為高水分豆粕，溫度采用60℃，以構(gòu)建一個(gè)高溫高濕環(huán)境模擬加速氧化。同時(shí)對(duì)經(jīng)過(guò)100℃干熱處理20min的豆粕進(jìn)行試驗(yàn)。貯藏1、2、4、6d后，分別對(duì)蛋白溶解度、羰基和自由巰基進(jìn)行測(cè)定。

2．5．1溶解度變化溶解度在一定程度上反映了蛋白的變性程度。從圖5可知:豆粕經(jīng)100℃、20min干熱處理，溶解度保持不變;隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，溶解度均顯著下降;經(jīng)干熱處理后，溶解度下降明顯比未干熱的緩和，但貯藏到第6天時(shí)，同樣降至很低。Pro－B與DHPro－B分別比Pro－H與DHPro－H，溶解度下降相對(duì)較快。說(shuō)明經(jīng)適度干熱滅酶處理不影響蛋白的溶解度，且能減緩溶解度降低，干熱與否Pro－B均比Pro－H更易氧化變性。

2．5．2羰基含量蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化可導(dǎo)致羰基產(chǎn)物的積累，蛋白質(zhì)羰基含量是蛋白質(zhì)氧化損傷的敏感指標(biāo)［16］。圖6顯示，在貯藏過(guò)程中，羰基含量逐漸增加，這是大豆脂肪氧合酶酶促氧化積累的結(jié)果。羰基含量:DHPro－B低于Pro－B，DHPro－H低于Pro－H;DHPro－B高于DHPro－H，Pro－B高于Pro－H。另外，在第6天時(shí)，由于Pro－B和Pro－H的溶解度過(guò)低，無(wú)法測(cè)出羰基含量。說(shuō)明經(jīng)適度干熱滅酶處理可以減少貯藏中蛋白的氧化損傷，干熱與否Pro－B均比Pro－H更易氧化。

2．5．3自由巰基含量半胱氨酸殘基可能是最敏感的氨基酸殘基，將巰基轉(zhuǎn)化為其他含硫氧化物是蛋白氧化的早期現(xiàn)象之一［17］。如圖7所示，在貯藏前2天，Pro－B與DHPro－B自由巰基含量逐漸減少，而Pro－H與DHPro－H是先增加后減少。第2天之后，Pro－B與Pro－H的自由巰基含量持續(xù)下降，而DHPro－B與DHPro－H則基本保持不變。自由巰基含量降低，意味著蛋白質(zhì)發(fā)生了變性，可能通過(guò)形成分子間二硫鍵聚集發(fā)生了氧化。自由巰基含量升高，是蛋白分子展開(kāi)、內(nèi)部基團(tuán)暴露的結(jié)果。說(shuō)明干熱滅酶處理能減弱自由巰基的氧化，干熱與否Pro－B在貯藏初期表現(xiàn)出比Pro－H較易氧化。殘余極性脂作為誘導(dǎo)豆粕蛋白氧化變性的主要因素，盡管DSF－B含量低于DSF－H，其油酸相對(duì)含量明顯低于豆粕－H，但貯藏過(guò)程中Pro－B更易被氧化。亞油酸和亞麻酸可以發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，而油酸不能，DSF－B的亞油酸和亞麻酸相對(duì)含量比DSF－H略高，Pro－B更易被氧化可能與此有關(guān)。

3結(jié)論

與正己烷制備豆粕相比，亞臨界丁烷脫脂豆粕蛋白得率較高，殘余極性脂總量低而磷脂(主要是PC)含量較高，在貯藏過(guò)程中蛋白更易被氧化，這可能與殘余極性脂組成差異有關(guān)。

作者：朱樂(lè)平 楊曉泉 單位：華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院 食物蛋白工程研究中心