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《中南林業(yè)科技大學學報》2015年第二期

1材料和方法

1.1實驗設備采用自制的模擬自然動態(tài)的、開頂式熏氣室，體積約1.5m3。O3由廣東省中山市聰明人環(huán)保科技有限公司生產(chǎn)的YIDAB-8D型號臭氧發(fā)生器產(chǎn)生，采用美國ECO公司生產(chǎn)的A-21ZX便攜式臭氧分析儀（靈敏度0.01×10-6，量程為0～10×10-6）對熏氣室中O3濃度進行實時測量。本試驗參照前人研究成果設置臭氧濃度和熏氣時間[16]，并根據(jù)本次的試驗材料和研究目的進行相應的調(diào)整，此外，在正式試驗開始前進行了預備試驗，綜合考慮制定如下試驗設計方案：試驗設4個處理：高濃度O3處理-E200（臭氧體積分數(shù)為200×10-9）、中濃度O3處理-E100（臭氧體積分數(shù)為100×10-9）、低濃度O3處理-E50（臭氧體積分數(shù)為50×10-9）和自然大氣處理-NF（臭氧體積分數(shù)為10×10-9～20×10-9）。每個處理設置3次重復，每次重復的熏氣時間為3d，選取10株苗木作為實驗對象。試驗時分別將秋楓和木棉的苗木各10盆放入熏氣室中，關(guān)閉氣室門，留出空隙以補充自然空氣，控制好臭氧發(fā)生器產(chǎn)生的O3的濃度和氣室空隙的大小，利用室內(nèi)風扇攪動空氣使氣體處于流動狀態(tài)，使熏氣室內(nèi)的O3濃度保持穩(wěn)定。從2010年4月16日起正式熏氣，每天熏氣時間為9:30～16:30，每小時測定一次O3濃度看其是否保持穩(wěn)定。4月19日停止供氣，試驗過程中水肥條件、溫度和病蟲害等因素可能有一定影響，但不成為主要限制因子。

1.2測定指標4月19日對4個處理的秋楓和木棉取樣，選取每株實驗苗自下而上的第2、3片葉片數(shù)片，用蒸餾水洗凈，濾紙吸干，去除葉片中脈測定各項生理指標。膜透性以相對電導率表示，相對電導率測定采用DDS-11A型電導儀，電導率為試驗苗葉片初始電導率與煮沸后電導率的比值；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍染色法測定[21]，以牛血清蛋白為標準蛋白；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度計法測定，以每分鐘每毫克蛋白氧化的H2O2毫摩爾數(shù)表示酶活性；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，以mg•min-1為單位[25]。

1.3數(shù)據(jù)處理方法應用MicrosoftExcel2003與R語言等軟件分析程序?qū)υ囼灁?shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1O3對膜脂過氧化程度的影響由圖1可知，木棉和秋楓葉片的MDA含量均隨臭氧濃度增加而上升，兩種植物的MDA含量與臭氧濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系（秋楓R2=0.889、木棉R2=0.7996），同種植物不同濃度處理之間差異極其顯著（p＜0.05）。這表明臭氧濃度升高，加劇了木棉和秋楓葉片的膜脂過氧化作用，加速了葉片的衰老進程。由圖2可知，木棉和秋楓葉片的膜相對透性均隨臭氧濃度增加而上升，且兩種植物的膜相對透性均與臭氧濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系（秋楓R2=0.995、木棉R2=0.7943），同種植物不同濃度處理之間差異顯著（p＜0.05）。這說明在高濃度臭氧暴露下，木棉和秋楓葉片的膜系統(tǒng)受到傷害。

2.2O3對可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響圖3表明，臭氧脅迫下，秋楓葉片可溶性蛋白含量隨臭氧濃度的升高而逐漸降低，在E50、E100、E200處理時，分別較對照（NF）降低14.07%、74.40%和96.93%；木棉葉片可溶性蛋白含量在E50、E100處理時分別降低19.00%和1.00%，而在E200處理時上升至7.46mg•g-1，較對照上升幅度達120.00%。如圖4所示，隨臭氧濃度的增加，木棉和秋楓葉片的可溶性糖含量變化一致。均是隨臭氧濃度的增加而上升，E50處理時達到最高值，分別為18.92mg•g-1、21.62mg•g-1，分別較對照升高18.16%和12.14%。而后在E100、E200處理時有小幅下降。

2.3O3對保護酶活性的影響由圖5可知，秋楓和木棉葉片POD活性隨臭氧濃度的增加先降低后升高，秋楓在E100處理時達到最低點，POD活性為0.24mg•min-1，在E200處理時則突然升高，POD活性為1.53mg•min-1；木棉葉片POD活性則在E50處理時達到最低值，為7.18mg•min-1，在E100和E200處理時分別較對照提高了109.24%和208.57%。圖6表明，秋楓葉片的過氧化氫酶活性呈先升高后降低的趨勢，在E100濃度處理時達到最高值，較對照升高161.86%；木棉葉片CAT活性隨臭氧濃度增加而降低。較對照分別降低16.67%（E50）、12.50%（E100）和68.33%（E200）。

2.42種植物適應O3脅迫能力的綜合評價采用主成分分析對2種苗木的耐臭氧脅迫能力做綜合評價。選E50、E100兩個濃度進行處理，其綜合得分排序均為秋楓＞木棉，表明秋楓耐臭氧脅迫的能力比木棉強。

3結(jié)論和討論

MDA是葉細胞代謝過程中產(chǎn)生的過氧化產(chǎn)物，其含量的高低是判定葉片衰老程度的重要指標，它反映了膜脂過氧化的程度，植物衰老進程的改變也能反映了植物受害程度，這在酸雨、二氧化硫及重金屬污染等研究中已得到證明。細胞膜是植物受臭氧脅迫時的原初反應基地[28]，如果植物在脅迫下還能保持其細胞膜結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的穩(wěn)定性，則其內(nèi)部發(fā)生的變化也是微弱的，并且危害通常也是可逆的。相反，如果膜的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，植物的局部和整體都可能受害，最后死亡。因此，臭氧含量超過一定濃度時，植物可能受到傷害。在本研究中，隨著臭氧濃度的增加，秋楓和木棉兩種植物葉片MDA的含量均顯著增加（p＜0.05），膜的相對透性也均顯著上升（p＜0.05）。說明兩種植物對臭氧脅迫均比較敏感，并且兩種植物體內(nèi)MDA和膜透性的增加具有同步性，這是因為在臭氧脅迫下，秋楓和木棉體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，而活性氧能使膜脂發(fā)生過氧化作用或脂膜脫脂作用(形成MDA),從而引起膜透性的增加。植物體內(nèi)可溶性蛋白是可轉(zhuǎn)運氮的貯存物，是植物進行各項生理生化過程的基礎。因此，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量的高低能反映出植物體生理生化活動的狀態(tài)。有研究表明，臭氧脅迫下大部分植物可溶性蛋白含量出現(xiàn)下降，而在部分重金屬污染的脅迫下植物體可溶性蛋白含量則表現(xiàn)出先升高再降低。本實驗研究中，隨臭氧濃度的增加，秋楓可溶性蛋白的含量逐漸降低，木棉則表現(xiàn)為先降低而后大幅度回升。從這一指標來看，木棉對臭氧脅迫保護性的適應性性更強。

可溶性糖是植物體碳素營養(yǎng)狀況和環(huán)境脅迫的指標，并且具有抗氧化作用，能減少植物細胞膜脂過氧化程度，對膜透性的變化起到一定的緩和作用，從而對植物產(chǎn)生一定的防護作用。在臭氧脅迫下，可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來適應脅迫，通常情況下，隨O3濃度的升高，植物體可溶性糖含量降低。本實驗中，秋楓呈上升后略為下降的趨勢，但總體上變化不明顯；而木棉則是呈先下降后升高的趨勢，表明木棉對O3濃度的敏感性較強。大量研究表明，逆境會影響植物的酶促系統(tǒng)。其中，POD、CAT等酶組成植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要保護酶，CAT、POD催化H2O2形成H2O，能夠在逆境脅迫中有效地清除植物體內(nèi)的活性氧，平衡活性氧的代謝，保護膜結(jié)構(gòu)。本實驗中，秋楓和木棉POD活性均是隨臭氧濃度的增加而呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，而CAT則是隨臭氧濃度的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。說明兩樹種對O3的脅迫反映特點基本一致。臭氧脅迫下，植物體生理生化活動的代謝特點和機制可能是：植物遭到臭氧脅迫時產(chǎn)生了大量活性氧和羥自由基，當植物體內(nèi)活性氧的濃度積累到一定濃度時，CAT、POD、SOD等抗氧化酶被誘導加速生成，SOD清除O2-•和OH•形成H2O2，CAT、POD催化H2O2形成H2O。這些酶活性的增加，機體內(nèi)膜保護系統(tǒng)被誘導而加強生理活動，是對O3污染的脅迫響應，更有利于活性氧的清除。另一方面，POD具有IAA氧化酶的活性，在臭氧脅迫下POD活性的增加和CAT活性的降低都不利于植物對活性氧的清除。

作者：郭雄飛黎華壽楊寶儀陳紅躍王志云單位：華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院佛山市林業(yè)科學研究所