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水稻是占全世界50%人口的主糧，自第1批水稻轉基因植株在1988年問世以來，許多國家在水稻轉基因研究中取得一系列成果，許多轉基因水稻育種材料已經進入田間試驗，并不斷向實用化方向發展。隨著轉基因產業的發展，轉基因食品的安全性問題受到廣泛關注，日本、歐盟等許多國家相繼建立了轉基因食品標識制度[1]。我國也于2002年3月20日起要求對5類轉基因生物所涉及的17種轉基因產品進行標識[2]。目前對轉基因植物產品的檢測方法主要分為兩類：第1類以導入外源基因的特定DNA序列為檢測對象的檢測技術，第2類以導入外源基因表達的蛋白質為對象的鑒定方法[3]。由于基于外源基因的檢測方法具有簡便、快速、準確等特點，成為轉基因作物檢測的常用技術，包括常規pcr、巢式和半巢式PCR、RT-PCR(reversetranscriptionPCR)、PCR-ELISA技術等。Dietrich等[4]針對轉基因水稻中的轉基因成分，利用實時熒光定量PCR法進行了檢測，檢測靈敏度為0.1%。陳茹等[5]利用PCR-ELISA技術建立了檢測轉基因水稻的體系，比常規電泳檢測可提高敏感性達1000倍。這些方法雖然對結果有更加準確的把握，但是操作過程復雜，檢測成本較高，對操作人員要求較高。多重PCR是指在一次PCR反應中同時加入多對引物，同時擴增多個目的基因，只需要一次PCR反應，就能同時檢測多個靶標基因，比傳統PCR方法節約時間，減少費用，目前這項技術在動物病毒性傳染病和人類疾病監測中應用較多。Ding等[6]通過對水稻、小麥、玉米等作物進行研究發現，蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)是水稻特有基因，可作為水稻內源基因。本研究在參考國標[7]中檢測的一些常見外源抗蟲基因的基礎上，選取蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作為內源參照基因，并選取花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、胭脂合成酶(NOS)終止子、β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、蘇云金芽胞桿菌Cry1Ab殺蟲晶體蛋白基因(Cry1Ab)、Cry1Ab基因與Cry1Ac基因經人工拼接形成的基因(Cry1Ab/Ac)、Bt毒蛋白基因(Btc)這6個外源基因，對這7個基因擬建立七重PCR反應體系，為快速鑒定轉基因水稻提供依據。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

轉基因水稻、大豆、菜籽粕廣東出入境檢驗檢疫局；轉基因棉花北京出入境檢驗檢疫局；轉基因玉米1中國農業大學；轉基因玉米2(Bt176)和轉基因玉米3(Bt11)上海交通大學；質粒PTF102(含GUS、NOS、CaMV35S基因)暨南大學生殖免疫研究所保存。WizardGenomicDNApurification試劑盒美國Promega公司；Taq聚合酶、dNTPs、10×PCRbuffer、MgCl2(25mmol/L)、100bpDNALadderMarker、6×LoadingBuffer、MultiplexPCRAssayKit大連寶生物工程有限公司；EB北京鼎國生物技術有限公司。ZN-02固體粉碎機北京新時利和科技發展有限公司；LG16-W型高速離心機北京醫用離心機廠；NANODROP1000生物分光光度計美國ThermoFish-ers公司；PT-1148MJminiThermalCyle梯度PCR儀、Sub-CellGTBASIC型核酸電泳儀美國Bio-Rad公司；AmpGeneGel3000凝膠成像儀北京鼎永科技有限公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取采用暨南大學食品科學與工程系食品安全實驗室建立的方法提取棉籽基因組DNA[8]，采用試劑盒法提取玉米、大米、菜籽粕基因組DNA，并用生物學分光光度計測定DNA的濃度和純度。

1.2.2引物設計參照國標(行標、農標)的引物在NCBI中檢索基因的原序列，利用PrimerPremierV5.0進行引物設計，再利用OligoV6.22對設計引物進行評估，篩選出引物之間相互干擾最小的引物組合，引物由上海生工生物技術有限公司合成(表1)。

1.2.3內源基因和外源轉基因的單一PCR檢測單一PCR反應體系包括：10×PCRbuffer5μL，dNTPmixture4μL，MgCl2(25mmol/L)3μL，引物終濃度各0.4μmol/L，模板DNA2μL，Taq聚合酶0.25μL，ddH2O將體積調整為54μL。PCR反應條件為94℃預變性5min、94℃變性40s、60℃退火60s、72℃延伸60s，30循環；72℃延伸5min。取5μLPCR產物，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4多重PCR體系的建立與檢測多重PCR反應體系包括：MultiplexPCRAssayKit中Mix1(含Buffer、dNTP、MgCl2)25μL，Mix2(含TaqTMDNA聚合酶)0.25μL，引物終濃度均為0.4μmol/L，模板DNA3μL(50ng/μL)，ddH2O將體積調整為50μL。PCR反應條件為94℃預變性1min、94℃變性30s、60.4℃退火90s、72℃延伸90s，35循環，72℃延伸10min。取PCR產物5μL于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5PCR產物的序列測定PCR產物測序委托上海博尚生物技術有限公司完成，序列結果用NCBI-BLAST在線軟件對其進行生物信息學分析。

2結果與分析

2.1DNA提取和轉基因成分單一PCR驗證及引物特異性驗證使用經改進后的Promega試劑盒提取樣品基因組DNA，經生物分光光度計檢測，OD260/OD280的比值在1.7～1.9之間，符合要求。經單一PCR反應分別檢測SPS、Btc、GUS、Cry1Ab/Ac、Cry1Ab、NOS、CaMV35S，其結果均呈陽性(圖1)。

2.2水稻七重PCR體系的建立在同一PCR體系中同時擴增7種基因(SPS內源基因、Btc基因、GUS報告基因、Cry1Ab/Ac抗蟲基因、Cry1Ab抗蟲基因、NOS終止子基因、CaMV35S啟動子基因)，對PCR擴增體系中各個引物的濃度配比進行調整，并研究最佳退火溫度。當引物終濃度配比為1:1:1:1:1:1:1時，退火溫度為60.4℃時，7個基因的條帶亮度較一致，多重PCR檢測結果與單一PCR檢測結果一致(圖1)。

2.3七重PCR擴增產物DNA序列測定七重PCR擴增產物委托上海博尚生物技術有限公司進行測序，測定結果在NCBI數據庫進行BLAST對比分析。據分析可知，各個基因的PCR擴增產物(SPS、Btc、GUS、Cry1Ab/Ac、Cry1Ab、NOS、CaMV35S)的DNA序列與已知序列的同源性分別為100%、99%、98%、100%、99%、99%、99%，從而證實PCR擴增產物確為目的擴增片段。

2.4七重PCR體系檢測已知轉基因樣品利用已經建立的水稻七重PCR體系來檢測已有的轉基因樣品，結果如圖2所示，泳道1有兩條清晰條帶，證明此菜籽粕樣品中含有NOS、CaMV35S基因；泳道2有3條清晰條帶，證明此棉花樣品中含有Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S三種基因；泳道3有3條清晰條帶，證明此玉米樣品3中含有NOS、CaMV35S、Cry1Ab/Ac三種基因；泳道4有3條清晰條帶，證明此玉米樣品2中含有Cry1Ab、NOS、CaMV35S三種基因；泳道5有2條清晰條帶，證明此大豆樣品中含有NOS、CaMV35S二種基因，泳道6有6條清晰條帶，證明此水稻樣品中含有SPS、Cry1Ab、Btc、Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S六種基因。轉基因大豆經檢驗檢疫行業標準[9]采用熒光定性PCR驗證含有NOS、CaMV35S；轉基因玉米2(Bt176)品種經檢驗檢疫行業標準[10]采用常規定性PCR驗證含有Cry1Ab、NOS、CaMV35S基因；轉基因玉米3(Bt11)品種經檢驗檢疫行業標準[10]采用常規定性PCR驗證含有Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S基因；轉基因菜籽粕經檢驗檢疫行業標準[9]采用熒光定性PCR驗證含有NOS、CaMV35S；轉基因棉花經檢驗檢疫行業標準[11]采用常規定性PCR驗證含有Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S基因；轉基因水稻經廣東出入境檢驗檢疫局根據檢驗檢疫行業標準[9]采用熒光定量PCR驗證含有SPS、Cry1Ab、Btc、Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S基因。因而圖2中的結果與檢驗檢疫行業標準方法檢測結果一致，證明建立的七重PCR檢測系統具有較好的可靠性和準確性。

3討論

本實驗對轉基因水稻中常見的7種基因建立了七重PCR體系，該體系只需1次PCR反應就能夠檢測出水稻中7種基因，大大提高了檢測速度和準確性，并利用該體系也能夠檢測其他一些轉基因作物如大豆、玉米等的轉基因成分，對于快速檢測轉基因產品有著重要的實用價值。王小琦等[12]針對轉基因水稻中常見的CaMV35S、NOS、Bt這3種轉基因成分，建立了三重PCR體系。李偉豐等[13]針對轉基因水稻中常見的CaMV35S、NOS、M.100bpLadderDNAMarker；1～7分別為SPS、Btc、GUS、Cry1Ab/Ac、Cry1Ab、NOS、CaMV35S基因的單一PCR產物；8為上述7種基因的多重PCR產物。圖1水稻轉基因成分的單一PCR檢測和多重PCR檢測結果；1～6分別為上述建立的水稻七重PCR體系檢測轉基因菜籽粕、轉基因棉花、轉基因玉米3、轉基因玉米2、轉基因大豆、轉基因水稻。圖2七重PCR體系分別檢測各已知轉基因樣品這6個基因，建立六重PCR體系。多重PCR有兩個關鍵，第1個是擴展的產物片段大小不能太靠近，如果擴展的產物片段大小太靠近，將無法利用凝膠電泳分開，無法得出準確結論。第2個是各對引物之間不能產生二聚體，本研究采用Primer5.0的Multiplexprimer功能，進行多條引物的二聚體檢驗，為了保證擴增產物片段長度在重新設計引物時不至于太大的變化，檢驗不合格的引物重新直接在Oligo6.0進行左右移動設計(將發生二聚體反應的那一條引物進行左右幾個堿基的移位，這樣同時不影響產物片段的大小和另一條引物)。在設計引物時充分考慮了這兩點，優先選擇目前已經的標準和文獻中的引物，Btc和Cry1Ab/Ac參考文獻[14]，其中Cry1Ab/Ac在參考文獻的基礎上為了增加Tm值，增加了引物的長度，使Tm值在70℃左右；GUS基因的引物參考了文獻[13]；Cry1Ab基因的引物參考文獻[15]；NOS基因的引物參考了國標[16]；CaMV35S基因的引物參考了文獻[17]；SPS基因的引物由本課題組自行設計并在NCBI中驗證其特異性。

在研究中發現，水稻中含有少許PCR抑制物，會影響多重PCR反應結果，產物條帶過暗或者不出，這種情況可以通過稀釋提取的水稻DNA可以得到緩解。其原因可能是當稀釋水稻基因組DNA時，抑制物也得到了相應的稀釋，進而抑制物在多重PCR反應過程中的作用被削弱，使多重PCR反應能正常進行。研究還發現，水稻多重PCR產物較其他作物的多重PCR產物更容易降解，PCR反應完全后應盡快電泳，避免降解。在其他條件不變的情況下，鎂離子濃度分別為2、2.5、3mmol/L時條帶逐漸由暗變亮，增加鎂離子濃度至3.5mmol/L時亮度基本不變，可以認為鎂離子濃度為3mmol/L已滿足此多重PCR體系的要求。