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《草地學報》2015年第六期

摘要：

以帶Epichloё內生真菌和不帶Epichloё內生真菌的野大麥（Hordeumbrevisubulatum）種子為試驗材料，在58±1℃和100％相對濕度條件下設置0，5，10，15，20，25，30和35min人工老化時間，研究老化過程中種子的活力變化以及內生真菌對種子的生理影響。結果表明：在人工老化過程中，種子的發芽率、發芽勢、胚芽胚根長和活力指數隨老化時間增加而降低；浸出液的電導率和可溶性糖含量隨老化時間的增加而增加，且與發芽率、發芽勢、胚芽長、胚根長和活力指數呈極顯著負相關（P＜0．01），但被內生真菌侵染的種子其老化生理反應變化明顯有所減緩。研究認為，與未被內生真菌侵染的種子相比，內生真菌可促進野大麥的發芽，促進芽長根長的生長，降低膜的損傷，減少浸出液電導率和可溶性糖的含量，從而降低種子的劣變程度，延長種子貯藏時限。

關鍵詞：

內生真菌；野大麥；種子；人工老化；活力

禾草內生真菌（grassendophyte；fungalendo－phyte；endophyticfungi）是指在禾草體內渡過整個或者大部分的生命周期，而禾草自身不顯示外部癥狀的一大類真菌［1］。內生真菌與植物形成互惠的關系，一方面可促進植物生長發育、增強植物的抗逆性和非生物脅迫的能力［2－3］，另一方面從宿主中吸收營養供自己生長需求。絕大多數內生真菌通過種子進行傳播［4］，多存在于禾草的地上組織。野大麥（Hordeumbrevisubulatum）是禾本科大麥屬優良的多年生禾本科牧草，多分布于我國東北、華北及新疆等低濕草地上，表現為生長期短、適口性好、耐鹽堿［5］、草質柔軟、生產性能良好，具有較高的經濟利用價值［6］，是一種良好的放牧－刈割兼用的多年生禾本科牧草。禾草和內生真菌的共生不僅為內生真菌提供了營養、生存環境及繁殖載體［7］，也促進了禾草的生長，防止或減少食草動物的采食，提高了其抗逆性。Wilson等首次在野大麥中發現了內生真菌［8］，內生真菌的侵染可顯著提高野大麥抗蟲［9］、耐鹽［5］等逆境條件抗逆性。

種子老化指的是種子發育完成其生理成熟期，其活力達最高水平，隨著時間及其環境的變化，引起種子內部生理生化過程的變化，活力不斷下降直至喪失生命力的綜合效應［10］。引起種子老化的原因主要有：貯藏物質的變化、代謝中產生有毒物質含量的變化、能量的變化、生物膜系統的變化、酶活性的變化及遺傳物質的改變等［11］。種子活力是決定種子萌發及其生長表現的重要特征，是反映種子老化水平的主要指標之一，在種子貯藏管理中具有重要的意義［12］。目前對于種子活力的檢測主要集中在對其物理特性（種子質量、顏色、大小等）、發芽特性（芽長、發芽率、發芽勢、發芽指數等）及生理生化特性（浸出液電導率、浸出液可溶性糖等）的測定。其中浸出液電導率的高低是反映老化過程中膜透性變化的重要指標；同時老化過程中可溶性糖的含量隨著種內貯藏物質的變化而變化，是評價貯藏物質變化的主要指標之一［13］。研究表明，內生真菌的侵染能促進種子的萌發，并提高其胚根、胚芽的長度及其幼苗的生物量［14－15］。相對于自然老化，人工老化有效縮短了處理周期，并且在模擬自然儲存種子的環境中人為進行老化處理，在短時間內進行高溫高濕處理，勢必會引起種子內部生理反應的差異［16］。對于探索種子老化過程機理以及尋找有效減緩種子活力下降方法具有重要的意義。本試驗以野大麥為試驗材料，采用人工模擬自然老化過程的方法，研究內生真菌在人工快速老化條件下對野大麥種子活力的影響，以期利用內生真菌在種子貯藏中的應用為種子的儲藏提供參考。

1材料與方法

1．1試驗材料供試材料野大麥于2013年采自甘肅省河西走廊的蘭州大學臨澤試驗站（E100°06′04″，N39°11′07″，海拔1783m），參照李春杰等［17］的方法對野大麥莖髓部進行內生真菌的檢測，收集帶內生真菌（E＋）與不帶內生真菌（E－）野大麥種子，4℃保存于農業部牧草與草坪草種子質量監督檢驗測試中心（蘭州），以保證種帶內生真菌的活性。

1．2人工老化處理隨機挑選帶菌（E＋）與不帶菌（E－）野大麥種子，在58±1℃和100％相對濕度條件下進行人工快速老化處理。老化時間分別為0（對照CK），5，10，15，20，25，30和35min，取出處理完成的種子在室溫條件下進行晾曬3至4天，使種子含水量盡量恢復至原始狀態，然后進行各項指標的測定。

1．3測試項目及方法

1．3．1萌發測定采用紙上（TP）發芽法，隨機挑選老化處理過的帶菌（E＋）與不帶菌（E－）種子各50粒于事先滅菌的培養皿進行萌發測試，各處理4個重復。參照衛東和王彥榮的方法［18］，放入光照培養箱（LRH－250－G）中，在25℃（恒溫）條件下進行測定，試驗持續12天，試驗期間保持濾紙濕潤，每天記錄種子發芽數，在種子發芽后的第5天測量胚芽長度（cm）和胚根長度（cm），統計發芽數，分別計算種子發芽勢、發芽率和活力指數。12天野大麥種子發芽結束后，最后統計發芽數并計算終期發芽率。發芽率＝發芽種子數／供試種子數×100％發芽勢＝第5天發芽種子數／供試種子數×100％活力指數＝（平均胚芽長＋平均胚根長）×發芽率

1．3．2浸出液電導率的測定分別挑選老化處理后的E＋、E－野大麥種子各50粒，3次重復，稱量（精確到0．001g）后用去離子水沖洗3次，置于150mL三角瓶中，加入100mL的去離子水，用封口膜封住瓶口，設空白對照（100mL的去離子水），于20℃下靜置24h備用。參照國際種子檢驗協會《種子活力測定方法手冊》［19］有關電導率的測定方法，用DDSJ－308A型數字式電導率儀測定浸出液的電導率［μs•（cm•g）－1］。浸種液電導率＝（樣品電導率－對照電導率）／樣品質量

1．3．3浸出液可溶性糖的測定參照李合生等［20］的方法，對老化處理后的野大麥種子可溶性糖含量進行測定。分別取老化處理后的E＋、E－野大麥種子0．5g置于150mL的三角瓶中，加100mL的去離子水，錫箔紙加蓋后在20℃恒溫下24h。分別移取各處理后的浸種液1mL于試管中，加入蒽酮試劑5mL，小心震蕩，使液體混合均勻，至沸水浴中10min后取出冷卻至室溫。以對照調零，采用紫外－可見分光光度計（WF－ZUV－2102型）在波長620nm下測光密度值，結合可溶性糖的標準曲線計算浸出液可溶性糖含量（μg•g－1）。

1．4數據處理和統計分析試驗所得數據錄入Excel2007并制圖，采用SPSS17．0軟件進行差異顯著性分析及相關性分析，并用Duncan法對各活力指標進行多重比較。

2結果與分析

2．1內生真菌對野大麥種子萌發和幼苗生長的影響

2．1．1對發芽率和發芽勢的影響在人工老化處理的過程中，E＋和E－野大麥種子發芽率的變化呈先緩慢下降，后大幅度下降的趨勢（圖1A）。其中E＋種子的發芽率要高于E－種子，老化5，10，15和20min后E＋和E－種子的發芽率差異顯著（P＜0．05），隨老化時間的增長，發芽率在老化25min后大幅度下降，在35min時降到最低，且E＋種子和E－種子的發芽率差異不顯著。隨老化程度的加劇，發芽勢呈現與發芽率相似的變化趨勢（圖1B）。老化5，10，15和20min后的E＋種子的發芽勢要顯著高于E－種子（P＜0．05），且E＋種子上升和下降的幅度要小于E－種子。

2．1．2對苗長、根長的影響種子發芽12天后，野大麥的苗長和根長隨著老化時間的增加而呈逐漸下降趨勢，其中E＋的苗長和根長始終大于E－。在老化5，10，15和20min后E＋的胚芽長顯著長于E－（P＜0．05），在老化5，10，15和25min后E＋的胚根長與E－差異顯著（P＜0．05）。

2．1．3對活力指數的影響隨人工老化程度的加劇，種子的活力指數先急劇下降后緩慢下降，E＋種子的活力要始終大于E－種子，其中老化0，5，10，15，20，25min后，E＋種子的活力要明顯高于E－（P＜0．05），而老化處理30，35min后，E＋和E－種子的活力指數沒有顯著差異，在35min后E－種子的活力基本喪失，活力指數為9．6（圖2）。

2．2內生真菌對野大麥種子生理指標的影響

2．2．1種子浸出液電導率電導率測定的結果顯示，隨著老化時間的延長，種子的電導率逐漸增加，在老化35min后達到最高，且E＋始終低于E－。在老化5，10，15，20min后E＋與E－之間差異顯著（P＜0．05），其他處理時間，E＋和E－之間差異不顯著（圖3）。

2．2．2種子浸出液可溶性糖含量在人工老化處理過程中，由于種子的膜透性發生改變，浸出液可溶性糖的含量隨老化時間的延長呈增加趨勢，其中E＋的含量要低于E－，且E＋變化幅度要大于E－。在老化0，5，10，15和20min后，E＋要明顯低于E－（P＜0．05），而其他處理時間下兩者差異不顯著（圖4）。

2．3野大麥種子生理指標與活力指標的相關性分析對野大麥種子的浸出液電導率和可溶性糖與種子的發芽率、發芽勢、胚芽長、胚根長和活力指數進行相關性分析，結果如表2所示。對野大麥種子浸出液電導率和可溶性糖與種子的發芽率、發芽勢、胚芽長、胚根長和活力指數的相關分析可知：電導率和可溶性糖與種子活力指標之間呈顯著負相關（表2）（P＜0．01）。

3討論

禾草內生真菌主要靠種子進行傳播［4］，本研究通過控制不同老化時間來觀察野大麥種子各生理生化指標，比較被內生真菌侵染（E＋）的野大麥種子和未被侵染（E－）種子各生理生活指標的不同，表明內生真菌在種子老化情況下對其貯存、生長的促進作用。種子活力與種子的貯藏、劣變、萌發等過程有著密切的聯系［21］，人工老化處理野大麥的種子，其發芽率、發芽勢、胚芽長、胚根長以及活力指數隨著老化程度的加劇而逐漸降低［22］，對于人工老化時間相同的種子，被內生真菌侵染的（E＋）野大麥種子各生理指標要明顯高于未被侵染的（E－），且變化幅度也小于未被侵染的（E－），由此可見內生真菌的存在為種子的萌發等帶來一定積極的影響。這與張興旭對內生真菌與保存時間互作對醉馬草（Ach－natheruminebrians）種子的生理影響研究結果類似，在不同處理時間下內生真菌可以顯著促進種子的萌發［23］。隨著人工老化時間的增加，種子的帶菌率逐漸降低，種子的活力指標也相應降低，以25min為指標變化的拐點，當種子的內生真菌基本失活后，內生真菌對種子的活力也失去了影響。人工老化與自然老化條件下種子的生理生化會產生相似的結果，都會表現出種子發芽率、發芽指數等活力指標的降低，以及種子可溶性糖泄露的增加［24］。國內外研究表明，種子劣變期間發生的最主要的生理變化是質膜受損，受損后膜的透性便增強，細胞內的電解質和代謝物的滲透量增大［25］，大量可溶性營養物質與蛋白質、糖、無機離子、氨基酸等滲漏出去［26］，同時還會釋放特定的氣體，使種子浸出液的導電性增強［27］，因此電導率和可溶性糖可作為測定種子活力的方法。本研究表明，在（58±1）℃熱水中進行種子老化，浸出液電導率和可溶性糖含量隨著老化時間的加長而增加。說明隨著老化處理時間的延長種子劣變加劇，細胞質膜的受損程度變大，種子內溶物透過膜外滲增加。但在有些禾本科種子老化的過程中，電導率與活力指標并無相關性。如王彥榮等對蘇丹草（Sorghumsudanense（piper）stafp）和老芒麥（ElymusSibiricus）等禾本科種子劣變研究過程中發現電導率與生活力無相關性［25］，這可能是由于種子結構、化學組成不同所引起的。試驗結果中種子浸出液的電導率和可溶性糖含量與種子各活力指標之間呈負相關，并且達到了極顯著水平。說明浸出液電導率和可溶性糖含量可作為評價野大麥種子活力的適宜指標。且本研究中被內生真菌侵染的野大麥種子電導率和可溶性糖的變化幅度要小于未被侵染的種子，表明內生真菌在一定程度上減緩了質膜的損傷程度，降低了膜的通透性，但隨著老化時間的加長，當內生真菌基本失活后，浸出液的電導率和可溶性糖含量與未被內生真菌侵染的種子基本相同。

4結論

在人工老化過程中，種子的發芽率、發芽勢和活力指數隨老化時間增加而降低；胚芽長和胚根長也隨老化時間的增加而減少；浸出液的電導率和可溶性糖含量隨老化時間的增加而增加，且與發芽率、發芽勢、胚芽長、胚根長和活力指數呈極顯著負相關（P＜0．01），但被內生真菌侵染的種子明顯減緩了種子老化生理反應變化的幅度。研究認為，與未被內生真菌侵染的種子相比，內生真菌可促進野大麥的發芽率，促進芽長根長的生長，降低膜的損傷，減少浸出液電導率和可溶性糖的含量，從而降低種子的劣變程度，延長種子貯藏時限。

作者：趙曉靜 李秀璋 王萍 李春杰 單位：草地農業系統國家重點實驗室 蘭州大學草地農業科技學院