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《草業學報》2016年第8期

摘要：

箭筈豌豆是我國傳統肥飼兼用的豆科綠肥作物，有關箭筈豌豆根瘤菌的研究尚屬空白。為獲得抗逆性強的根瘤菌菌株，在青海主產區采集樣本，經分離、鑒定得到61株箭筈豌豆根瘤菌。采用水培回接法，通過主成分分析篩選出5株對宿主結瘤生長促進作用較強的根瘤菌。對該5株根瘤菌進行了離體耐鹽性評價，發現菌株J5－5－3最大耐鹽極限值在0．9％左右，其他4菌株最大耐鹽極限值均在1．2％左右，并且5菌株的耐鹽特征呈3個明顯不同類型：J3－12－1和J2－6－2耐鹽性最強，菌株J1－3－2和J4－3－3居中，菌株J5－5－3最差。進一步采用盆栽方法評價了其中3株（每類型1株）根瘤菌－箭筈豌豆共生體的耐鹽性，結果表明，在0．15％NaCl脅迫下接種根瘤菌J5－5－3植株結瘤數最多，在0．30％NaCl脅迫下3種接種處理無顯著差異；在0．15％和0．30％NaCl脅迫下，接種J3－12－1共生體株高顯著大于對照（P＜0．05）；在0．15％和0．30％NaCl脅迫下根瘤菌J3－12－1和J5－5－3可顯著提高植株干重（P＜0．05）；J5－5－3在0．15％和0．30％NaCl脅迫下可顯著提高植株含氮量并顯著提高0．15％NaCl脅迫下的植株吸氮量（P＜0．05）；J3－12－1顯著提高了0．15％NaCl脅迫下的植株吸氮量（P＜0．05）。綜合來看，J3－12－1和J5－5－3可以作為在鹽脅迫下提高箭筈豌豆生物量和含氮量的預選菌株。

關鍵詞：

箭筈豌豆；根瘤菌；鹽脅迫

根瘤菌與豆科植物形成的固氮共生體是生物固氮中最強的體系，其固氮量約占生物固氮總量的65％以上，對農業生產有重要意義［1］。共生固氮可以為宿主植物提供氮素，從而提高作物產量［2］、改善作物品質、提高土壤氮素含量［3］。提高豆科綠肥及飼草固氮效率，是提高鮮草產量、減少化肥用量［4］、減緩能源壓力、降低過量施用化學肥料造成的環境污染的有效途徑［5－6］。箭筈豌豆，又名大巢菜，豆科野豌豆屬，一年生或越年生豆科草本植物［7］，性喜冷涼，不怕霜凍，且耐陰性好、再生力強。箭筈豌豆是北方冷涼地區春季以及南方地區冬季常用綠肥及飼草作物［8］之一，但目前有關箭筈豌豆根瘤菌的研究工作少見報道，生產中還沒有與箭筈豌豆匹配的根瘤菌菌劑。箭筈豌豆根瘤菌研究的欠缺，限制了箭筈豌豆作為豆科綠肥固氮潛能的發揮。土壤鹽堿化是國內外普遍存在的問題。我國鹽堿化耕地超過1．5×109hm2，在青海省等西北干旱半干旱地區分布面積大。土壤鹽分脅迫對結瘤和固氮作用的影響在部分研究中有報道［9］，鹽分對固氮作用的不利影響通常與鹽脅迫所造成的植株干重及氮含量的下降直接相關［10］，在土壤鹽分脅迫條件下對共生固氮而言最好的結果就是宿主、根瘤菌以及兩者的交互過程均表現為對鹽分的適應［11］。青海地區是典型的大陸性高原氣候，地形復雜、地貌多樣、生物種類多，是一個巨大的基因庫。在青海省，箭筈豌豆種植廣泛，且多與小麥、油菜輪作［12－13］，不但可作綠肥，還可以刈青作飼料和收籽作種子。在青海等西北地區，土壤鹽漬化也是農業面臨的重大問題之一。本研究在對青海地區箭筈豌豆根瘤菌分離和初篩的基礎上，對初篩獲得的根瘤菌進行了耐鹽性研究，為豆科綠肥飼草的應用和推廣提供科學支撐。

1材料與方法

1．1根瘤菌菌株的采集、分離和鑒定

2014年在青海省海東市互助土族自治縣和平安區采集根瘤樣本，經過分離、純化、鏡檢、16SrDNA測序分析，獲得61株根瘤菌（表1），以這些菌株作為后期研究的供試菌株。

1．2供試箭筈豌豆

758選箭豌，由綠肥種質資源平臺提供，國家種質資源庫編號I7A00224。

1．3根瘤菌結瘤效果評價

2014年12月進行。按照馬曉彤［14］所述的水培方法，設61個接種根瘤菌處理，1個不接種對照處理，4次重復。將植株放置于光照培養箱中培養（光照16h、光照強度8000lx、有光溫度20℃；無光照8h、無光溫度15℃），定期更換營養液，45d后測定植株地上鮮重、植株有效瘤數（粉紅色或淺粉紅色）、有效瘤重等指標。水培溶液采用松本哲良營養液［15］：KH2PO42．2g，KCl15．5g，MgSO4•7H2O25．0g，CaCl2•2H2O21．5g，檸檬酸鐵3．0g，MnSO4•H2O100mg，ZnSO4•7H2O25mg，H3BO325mg，CuSO4•5H2O25mg，Na2MoO4•2H2O5mg；以上試劑分別溶于500mL蒸餾水中，用時稀釋200倍。

1．4根瘤菌離體耐鹽性評價

2015年1月，將在1．3初篩中獲得的5株固氮效果較好的菌株用于根瘤菌耐鹽性評價。設8個NaCl處理濃度：0．00，0．30％，0．60％，0．90％，1．20％，1．50％，1．80％，2．10％。配制相應NaCl濃度的YMA液體培養基，并將其分裝至1．5cm×15cm試管中，每管5mL，121℃、30min高壓蒸汽滅菌后備用。將根瘤菌轉接到根瘤菌斜面培養基中，28℃、72h培養；鏡檢以確定培養物是否被污染，然后轉接到YMA液體培養基中，28℃、160r／min、72h搖瓶培養；將各菌液OD600值調一致（OD600＝0．8），取100μL菌液接種于相應YMA液體培養基中，3次重復，28℃、160r／min、72h搖床培養；使用紫外分光光度計測定不同菌液OD600值。YMA液體培養基［16］：甘露醇10g，酵母膏1g，K2HPO40．5g，MgSO40．2g，NaCl0．1g，H2O1L。根瘤菌培養基：K2HPO40．5g，MgSO4•7H2O0．2g，NaCl0．1g，甘露醇10g，CaCO31．5g，1％Na2MoO42mL，1％H3BO32mL，酵母粉0．8g，0．5％剛果紅5mL，瓊脂22g，pH＝7．0，H2O1L。

1．5共生體耐鹽性研究

采用盆栽試驗，2015年4月進行。在1．4試驗基礎上得到耐鹽性有差異的3個菌株用于本試驗。設3個鹽濃度水平：0．00，0．15％和0．30％，分別接種3個根瘤菌菌株，同時設1個不接種對照，共12個處理，4次重復。分別接種3菌株于YMA液體培養基中，搖瓶培養72h，將各菌液OD600值調一致（OD600＝0．8）。選擇粒大飽滿的箭筈豌豆種子，浸于10％H2O2中5min，洗凈，于培養皿中28℃催芽2d。選擇發芽一致的種子于相應菌液中浸泡1h（不接種根瘤菌對照處理同時進行）后播種于裝有蛭石的10cm×10cm×10cm盆缽中，每盆3棵。每處理12盆。在光照培養箱中培養（光照16h、光照強度8000lx、有光溫度20℃；無光照8h、無光溫度15℃），定期澆注Fahraeus無氮營養液。7d后，每處理隨機分為3組，分別澆灌40mLNaCl含量為0．00，0．15％，0．30％營養液，每3d澆灌1次；第45天測定植株株高、結瘤數、干重和含氮量（凱氏定氮法）等指標。Fahraeus無氮植物營養液［17］：Na2HPO4•12H2O0．15g，MgSO4•7H2O0．12g，檸檬酸鐵0．005g，CaCl2•2H2O0．1g，KH2PO40．1g，Gibson微量元素液1mL，H2O1000mL（Gibson微量元素液：H3BO32．68g，MnSO4•4H2O2．03g，ZnSO4•7H2O0．22g，Na2MoO4•2H2O1．26g，CuSO4•5H2O0．08g，H2O1000mL）。

1．6數據處理

相對OD600值＝接種根瘤菌處理OD600值／對照OD600值。相對OD600值可以用來表征在離體培養條件下根瘤菌的耐鹽性。采用EXCEL2007和SAS8．1進行計算和統計分析。

2結果與分析

2．1根瘤菌結瘤效果

利用水培回接法測定了62個處理的有效結瘤數、有效瘤重、植株鮮重等指標。為了更客觀地進行根瘤菌結瘤效果評價，采用主成分得分法進行數據處理，根據特征值大于1且累計貢獻率大于80％的原則，把測定指標轉化為累計貢獻率為86．26％的2個主成分（主成分1和主成分2的方差貢獻率分別為65．67％和20．95％），各處理得分如表2所示。菌株J1－3－2得分最高，對促進箭筈豌豆生長結瘤效果最好；其次為菌株J2－6－2、J4－3－3、J5－5－3和J3－12－1；菌株J5－10－1和J1－2－1得分最低。選擇菌株J1－3－2、J2－6－2、J4－3－3、J5－5－3和J3－12－1用于下一步根瘤菌耐鹽方面研究。

2．2根瘤菌耐鹽性

OD600值是在600nm波長下測定的菌液吸光度，在測定系統相同、培養體系相同的條件下，OD600值與菌液的濃度呈正比，可以用來衡量菌液濃度。圖1表明，菌株J1－3－2、J2－6－2、J4－3－3、J5－5－3和J3－12－1均表現為隨NaCl濃度的提高，菌液OD600值降低，菌濃度下降，根瘤菌的生長受到抑制，并且抑制程度隨NaCl濃度增加而增加。在無鹽脅迫下，5菌株的OD600值略有差異，J1－3－2、J2－6－2的OD600值最高，J5－5－3的其次，J3－12－1、J4－3－3的最低。在0．30％NaCl脅迫下，J5－5－3的OD600值急劇下降，明顯低于其他4菌株，并且菌株J1－3－2、J2－6－2的OD600值依然高于J3－12－1、J4－3－3。在0．60％NaCl條件下，J5－5－3的OD600值進一步降低至0．09，J1－3－2、J2－6－2的OD600值略高于J3－12－1、J4－3－3，但4菌株間差異縮小。在0．90％NaCl條件下，各處理OD600值繼續降低，J5－5－3的OD600值接近0，但總體規律與0．60％條件下的類似；NaCl濃度超過1．20％后，5菌株OD600值接近0。細菌生長率受細菌本身特性的影響較大，不同菌種其生長曲線不同。相對菌濃度（相對OD600值表征）可以更為客觀地反映菌株在鹽脅迫下的相對耐鹽性；在給定鹽度脅迫下，相對菌濃度越大，說明耐鹽性越強。表3可以反映出隨鹽脅迫程度的增強，根瘤菌相對菌濃度及其生長受抑制程度的變化趨勢。在低濃度0．30％NaCl脅迫下，菌株J5－5－3的相對OD600值快速下降，菌株J2－6－2、J4－3－3居中，菌株J1－3－2、J3－12－1受抑制較小，菌株J1－3－2、J3－12－1、J2－6－2、J4－3－3、J5－5－3受抑制率分別為6．7％，6．3％，11．5％，11．2％和67．4％。在中濃度0．60％NaCl脅迫下，各菌株受抑制程度進一步增大，但總體規律與低濃度較為相似，受抑制率分別為37．2％，41．7％，56．1％，49．9％和94．2％。高濃度0．9％NaCl脅迫下，受抑制率分別為67．9％，79．3％，84．7％，86．3％和97．5％。在1．20％～2．10％NaCl濃度范圍內，同一種菌液OD600值沒有顯著性變化（P＞0．05）；除根瘤菌J2－6－2外，其他4菌株相對OD600值無顯著性差異。綜上，供試5菌株在離體耐鹽性上綜合表現出明顯的3個類型，即菌株J3－12－1和J2－6－2隨NaCl濃度的增加，相對OD600值下降較緩，表現出較強的耐鹽性，菌株J1－3－2和J4－3－3居中，菌株J5－5－3最差。

2．3根瘤菌－箭筈豌豆共生體耐鹽性

選擇上述3個類型中的各1株根瘤菌，即J1－3－2、J3－12－1和J5－5－3用于根瘤菌－箭筈豌豆共生體耐鹽性盆栽試驗。

2．3．1NaCl濃度對箭筈豌豆結瘤數的影響

接種3株根瘤菌處理都能增加箭筈豌豆植株根部結瘤數，結瘤數隨根瘤菌種類和NaCl脅迫強度的不同而不同（圖2）。同時，圖2表明隨著鹽脅迫程度的增強，3種共生體結瘤數表現出減少的趨勢。在無鹽脅迫和0．15％NaCl脅迫下，接種J5－5－3結瘤數最多，接種J1－3－2結瘤數最少；在0．30％NaCl脅迫下，接種J1－3－2結瘤數最多，接種J5－5－3結瘤數最少。可見，根瘤菌J5－5－3在低鹽脅迫下促結瘤能力較強；J1－3－2在高鹽脅迫下有促結瘤的趨勢。

2．3．2NaCl濃度對箭筈豌豆株高的影響

由圖3可知，各根瘤菌－箭筈豌豆共生體株高隨鹽脅迫程度的增強而降低。在無鹽脅迫下，接種J3－12－1共生體株高顯著大于對照（P＜0．05）；接種J1－3－2和J5－5－3與對照相比沒有顯著性差異（P＞0．05）；在0．15％和0．30％NaCl脅迫下，接種J3－12－1共生體株高顯著大于對照（P＜0．05）。

2．3．3NaCl濃度對共生體干生物量的影響

如圖4所示，不同共生體干重隨NaCl脅迫程度的增強而降低。在無鹽脅迫下，J3－12－1和J5－5－3共生體干重顯著高于對照，分別比對照提高了28．02％和13．59％，其中J3－12－1達極顯著水平（P＜0．01）；在0．15％NaCl脅迫下，J3－12－1和J5－5－3共生體干重分別比對照高66．40％和20．72％，并且差異達到極顯著水平（P＜0．01）；在0．30％NaCl脅迫下，3種接種處理對提高植株干重都沒有顯著效果（P＞0．05）。

2．3．4NaCl濃度對箭筈豌豆含氮量和吸氮量的影響

如圖5所示，箭筈豌豆含氮量隨著鹽脅迫程度的增強表現出降低的趨勢。在無鹽脅迫和0．15％NaCl脅迫下，接種J5－5－3對提高植株含氮量都有極顯著效果（P＜0．01），比對照分別提高了3．07％和5．43％，接種其他2菌株對提高植株含氮量沒有顯著效果。在0．30％NaCl脅迫下，接種J1－3－2、J3－12－1和J5－5－3能使植株含氮量提高2．35％，0．92％和4．48％。可見，在試驗條件下，J5－5－3對提高鹽脅迫下箭筈豌豆含氮量效果最好。在沒有外源氮素供應的情況下，植株吸氮量的高低反映了根瘤菌－豆科植物共生體利用空氣中游離態氮合成銨態氮并為植物體利用的能力。由圖6可知，在無鹽脅迫和0．15％NaCl脅迫下接種J3－12－1和J5－5－3對提高植株吸氮量都有顯著效果（P＜0．05），分別比對照提高26．92％，9．86％和64．93％，27．27％。在0．30％NaCl脅迫下，各接種處理與不接種相比，植株吸氮量沒有顯著差異（P＞0．05）。

3討論

回接結瘤試驗是確定共生固氮根瘤菌比較可靠的方法。從豆科植株根瘤中分離獲得的菌株只有在原寄主根部結瘤才能確定該菌為具有結瘤固氮能力的根瘤菌［18］。水培試驗作為簡便、直觀、有效的方法被用于根瘤菌與宿主匹配性研究中。馬曉彤［14］采用水培法初篩獲得了幾株與不同苜蓿品種匹配的根瘤菌；管鳳貞等［19］采用水培法和盆栽法篩選出對紫云英有較好結瘤固氮效果的根瘤菌。本研究通過水培回接結瘤試驗從61株根瘤菌中初篩出5株與箭筈豌豆共生并且結瘤效果較好的根瘤菌。本試驗結果，在不同程度鹽脅迫下，根瘤菌耐鹽性表現強弱不同，比如在0．30％NaCl脅迫下菌株J1－3－2和J3－12－1耐鹽性最強，在0．60％NaCl脅迫下菌株J3－12－1耐鹽性最強，在0．90％NaCl脅迫下菌株J2－6－2耐鹽性最強。這可能與細菌在不同鹽脅迫下體內積累親和性溶質（氨基酸及衍生物等）來保持細胞內外的滲透壓平衡［20］的能力不同有關，也可能與誘導菌體耐鹽相關基因［21］（編碼氨基酸合成基因等）表達的鹽濃度高低不同有關。此外，在1．20％～2．10％NaCl范圍內，菌液OD值沒有明顯波動，這與郭麗琢等［22］研究的豌豆根瘤菌在1．00％～4．50％NaCl濃度下菌液OD值變化趨勢一致，說明在超過一定程度鹽脅迫下根瘤菌幾乎受到完全抑制而沒有明顯的增殖。分離篩選獲得的耐鹽根瘤菌能否與其寄主形成較好的共生關系，是科研工作者關注的問題，因此有必要在鹽脅迫條件下對根瘤菌進行盆栽回接試驗。本研究中，盆栽試驗所用營養液為無氮營養液，接種菌株J3－12－1和J5－5－3能使共生體氮含量增加。這些氮是根瘤菌在宿主根部形成的根瘤將空氣中游離態氮在固氮酶的作用下轉化為銨態氮供宿主植物利用［23］的結果。根瘤菌與植株互作能增強共生體抗逆性［24－28］。楊培志［24］研究表明，接種根瘤菌的苜蓿抗非生物脅迫的能力可能來源于三方面：根瘤菌的固氮作用、根瘤菌與苜蓿的共生免疫作用、根瘤菌固氮對植株自身組成變化或其生理應答機制的改變。王衛棟等［25］的研究表明，接種根瘤菌激活的紫花苜蓿具有較強的抗氧化和滲透調節能力，接種根瘤菌不激活的紫花苜蓿次之，不接種根瘤菌的紫花苜蓿最弱。抗氧化和滲透調節能力增強，說明苜蓿耐鹽能力提高，也同樣說明接種根瘤菌后形成的共生體耐鹽性可能發生變化。本研究中，菌株J5－5－3在根瘤菌耐鹽性的離體鑒定中表現最差，但在共生體耐鹽性鑒定中其共生體在干重、吸氮量等方面表現較好，說明在離體培養條件下測定的相關生理指標不能完全與實際應用條件下的相關指標相符，原因可能是根瘤菌需與宿主之間形成較好的匹配性。共生體的形成是一個根瘤菌與植株互作的復雜過程［29］，在此過程中，菌體和植物體雙方自身組成、生理特性及生理應答機制發生不同程度變化。因此，在對根瘤菌進行篩選和耐鹽性研究時，需關注其在離體培養和生產應用中表現出的生理特性的差異。同時，所選出的高效共生體系在實際生產環境中的效果要通過鹽漬地大田試驗進一步驗證［30］，使根瘤菌能在與豆科綠肥聯合固氮和提高植株耐鹽能力方面發揮更好的潛力。

4結論

本研究對青海高原土著箭筈豌豆根瘤菌進行了篩選及耐鹽性評價。篩選出5株結瘤效果較好的根瘤菌J1－3－2、J2－6－2、J3－12－1、J4－3－3和J5－5－3。離體培養試驗結果，5個菌株在不同程度鹽脅迫下耐鹽性強弱不同，呈三類明顯的特征，即J3－12－1和J2－6－6耐鹽性最強，J1－3－2和J4－3－3居中，J5－5－3最差。共生體耐鹽性鑒定結果與離體培養試驗結果不盡一致，表現為接種J3－12－1和J5－5－3在中、低濃度NaCl脅迫下促進共生體生長能力較強。總體來看，菌株J3－12－1和J5－5－3具有耐鹽性應用前景。

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作者:王雪翠 馬曉彤 韓梅 曹衛東 張宏亮 白金順 曾鬧華 高嵩涓 周國朋 王艷秋 單位:中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所 中國農業科學院研究生院 青海大學青海省農林科學院土壤肥料研究所