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《動物醫(yī)學進展雜志》2016年第9期

摘要：

為制備犬細小病毒膠體金免疫層析試紙，將F81細胞中分離的CPV免疫Balb／c小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞融合，建立間接ELISA方法篩選分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細胞，獲得1株能穩(wěn)定分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3E2。3E2的亞類為IgG1型，腹水抗體效價為1．8×105，交叉試驗表明，3E2可與CPV特異性結(jié)合，與其他犬常見病毒無交叉反應(yīng)。用3E2單克隆抗體制備的檢測CPV的膠體金免疫層析試紙條特異性良好，為診斷和研究CPV奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：

犬細小病毒；病毒分離；單克隆抗體；膠體金免疫層析試紙

犬細小病毒病是由犬細小病毒所引起的傳染性疾病，可通過直接或間接接觸傳播，以劇烈的嘔吐、腹瀉和白細胞減少為主要特點，可引起犬急性心肌炎。犬細小病毒傳播性強，發(fā)病率和病死率較高，且可感染狐、貉、狼等動物，對養(yǎng)犬業(yè)和皮毛動物等經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)可造成巨大經(jīng)濟損失［1］。1977年，美國科學家最先從患腸炎的犬糞便中分離出CPV。1983年，徐漢坤等首次報道了犬細小病毒病在我國的出現(xiàn)。CPV在分類上屬細小病毒科，病毒呈圓形或六邊形，無囊膜，直徑約25nm。病毒顆粒具有球型的衣殼，衣殼內(nèi)包含單鏈線狀DNA，在DNA兩端各有一個發(fā)夾樣的回文結(jié)構(gòu)，DNA量占整個病毒粒子重量的25％～34％。CPV基因主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2。VP1和VP2構(gòu)成病毒的衣殼，其中VP2是主要結(jié)構(gòu)成分和免疫原性蛋白，能夠促使機體產(chǎn)生中和抗體［2］。VP1和VP2蛋白對病毒與宿主細胞之間的識別起重要作用，刪除VP1或VP2蛋白的突變體均失去了對宿主細胞的感染能力。近年來，CPV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1被認為在病毒的致病性和細胞毒方面起主要作用，并在體外可引起腫瘤細胞凋亡［3－5］。目前國內(nèi)外對犬細小病毒的診斷主要通過臨床癥狀診斷、血常規(guī)檢查和試紙快速診斷等，前兩者存在著依賴臨床經(jīng)驗、特異性低等缺點，難以達到對犬細小病毒病快速診斷的要求；而快速診斷試紙條主要被國外產(chǎn)品所壟斷［6］。本研究用F81細胞分離的CPV制備獲得了單克隆抗體，并用單克隆抗體，初步制備了CPV的膠體金層析快速檢測試紙條。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物、細胞株及毒株

貓腎細胞系細胞（F81），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；犬細小病毒病料，河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)院提供；SP2／0多發(fā)性骨髓瘤細胞，河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院生物技術(shù)實驗室保存；Balb／c小鼠和日本長耳大白兔，購自河南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心；含有CPVVP2基因的重組質(zhì)粒pGEX－6p－1－VP2，河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院生物技術(shù)實驗室構(gòu)建并保存；犬瘟熱病毒（CDV）、犬冠狀病毒（CCV）和犬腺狀病毒（CAV），河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院生物技術(shù)實驗室鑒定并保存。

1．1．2主要試劑與藥品

dNTP、DNA提取試劑盒、瓊脂糖、DNAMarkerDL2000和蛋白分子質(zhì)量標準等，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DMEM、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、50倍HAT貯存液，GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，Hyclone公司產(chǎn)品；HRP－羊抗鼠IgG、HRP－羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG抗體、PEG4000、DMSO、BSA及氯金酸，Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜（NC膜），Millipore公司產(chǎn)品；樣品墊和PVC底板，上海金標生物科技有限公司產(chǎn)品；SBAClonotypingSystem／HRP抗體亞類鑒定試劑盒，SouthernBiotechnology公司產(chǎn)品；引物合成和序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；CPV多抗IgG由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院生物技術(shù)實驗室制備；犬細小病毒陰性血清由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)院提供；其他常規(guī)用試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1．2方法

1．2．1病毒的鑒定

樣品由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)院提供。采集出現(xiàn)血便、高熱等疑似CPV感染的犬糞便，加入適量磷酸鹽緩沖液，5000r／min離心10min，收獲上清液。按常規(guī)DNA提取方法提取DNA，置于－20℃保存?zhèn)溆谩⒄誄PV基因序列（基因登錄號：M19296．1），設(shè)計引物序列為：上游引物P1：5′－AATCACAGCAAACTCAAG－CAGAC－3′；下游引物P2：5′－TAGCAAATTCAT－CACCTGTTCTTAG－3′。以提取的DNA樣品為模板，使用Taq酶擴增，反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30個循環(huán)；最后72℃10min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL用10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果［7］。

1．2．2病毒的分離和抗原的制備

將采集的病料加入含1000單位／mL青霉素和鏈霉素的DMEM細胞維持液（含20mL／L胎牛血清）制成1∶9的懸液，混勻后5000r／min離心20min，取上清，用0．22μm微孔濾膜過濾，置－20℃保存?zhèn)溆谩螌拥腇81細胞用胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，按體積10％的病料上清同步接種F81細胞，置37℃、體積分數(shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)立陰性對照，同時逐日觀察細胞病變并進行盲傳［8－9］。待細胞病變達到80％以上時，反復(fù)凍融3次，10000r／min4℃離心30min，收獲上清，加入PEG6000濃縮，經(jīng)過Sepharose4FF凝膠柱層析，收集洗脫峰即為CPV抗原，紫外分光法檢測CPV濃度，保存于－80℃。

1．2．3間接ELISA檢測方法的建立

以純化的VP2蛋白作為包被抗原［10］，采用方陣滴定確定陽性血清的最佳濃度和最佳抗原包被濃度，建立了間接ELISA方法。通過酶標儀讀取OD值判定結(jié)果，以O(shè)D待檢血清＞0．4且P／N≥2．1為陽性判定標準。另外檢測30份犬細小病毒陰性血清450nm波長處的OD值，并將平均OD值與3倍的標準差（SD）之和作為陰陽性的臨界值，即珚x＋3SD為確定的陰陽性界限［11］。

1．2．4小鼠的免疫

將純化的CPV抗原加等體積弗氏完全佐劑初次免疫6周齡Balb／c小鼠，每隔2周分別再注射2次以加強免疫。細胞融合前3d再加強免疫1次注射抗原。

1．2．5雜交瘤細胞的篩選和McAb腹水制備

按常規(guī)方法進行細胞融合，使用建立的間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)，選擇能夠穩(wěn)定分泌、效價較高的單個克隆進行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備腹水，并采用辛酸－硫酸銨鹽析法和親和層析法純化腹水中的McAb［12］。

1．2．6McAb亞型鑒定及染色體計數(shù)

①采用SBAClonotypingSystem／HRP抗體亞類鑒定試劑盒測定制備的CPVMcAb的Ig亞類。②選擇生長良好的雜交瘤細胞，用秋水仙素阻斷法進行染色體核型分析，在顯微鏡下選擇染色體分散良好的細胞觀察計數(shù)。

1．2．7McAb的特異性分析

將犬細小病毒（CPV）、犬瘟熱病毒（CPV）、犬冠狀病毒（CPV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV）作為包被抗原進行間接ELISA，檢測該單克隆抗體的特異性。

1．2．8膠體金抗體的制備

將200mL0．1g／L氯金酸溶液，攪拌加熱至沸騰，迅速加入2mL10g／L檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色從淺黃逐漸變黑，然后變紅，繼續(xù)煮沸10min，溶液冷卻后微孔濾膜過濾，4℃下保存?zhèn)溆谩⒅苽涞哪z體金，調(diào)整pH至8．0后加純化后的3E2單抗攪拌，室溫靜止5min，經(jīng)低溫高速離心法純化獲得膠體金抗體［13］。

1．2．9免疫試紙條的制備和初步鑒定

在玻璃纖維上噴涂膠體金抗體。取蛋白濃度為1．5mg／mL的CPV多抗IgG標記在硝酸纖維素膜上，設(shè)為檢測線；取蛋白濃度為1．0mg／mL的羊抗鼠IgG抗體噴在離檢測線5mm處，即為質(zhì)控線；將噴有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜與樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水紙組裝成試紙條。取PCR和ELISA鑒定的犬細小病毒（CPV）、犬瘟熱病毒（CDV）、犬冠狀病毒（CCV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV），用制備的膠體金試紙條進行檢測，驗證其特異性。

2結(jié)果

2．1PCR鑒定

通過PCR擴增，得到608bp左右的預(yù)期大小目的片段，經(jīng)測序與預(yù)期序列一致，證明樣品中含有CPV（圖1）。

2．2病毒的分離

從第3代開始一般會出現(xiàn)規(guī)律性細胞病變，接種病料上清液后約24h～36h，細胞出現(xiàn)彌散性顆粒，胞漿收縮，細胞變圓；約48h病變細胞開始逐漸拉網(wǎng)、崩解、脫落；約72h～96h，細胞病變達80％以上時，收毒，置－80℃保存?zhèn)溆茫▓D2）。

2．3間接ELISA方法建立

采用方陣滴定確定抗原的最佳包被濃度和陽性血清最佳稀釋度，陽性判斷標準為OD待檢血清＞0．4，且OD待檢血清／OD標準陰性值≥2．1，當抗原的稀釋濃度為1∶160，血清的稀釋度為1∶80，陰性與陽性血清的OD450nm值相差最大（P／N＝9．253）。建立了篩選犬細小病毒McAb的間接ELISA方法（表1）。

2．4雜交瘤細胞株的篩選

經(jīng)脾細胞與骨髓瘤細胞SP2／0細胞融合并篩選，獲得1株能高效分泌抗CPV單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3E2。間接ELISA檢測，3E2腹水效價為1∶1．8×105。

2．5McAb的Ig亞類鑒定檢測

抗體的Ig亞類，結(jié)果表明，3E2亞類為IgG1型。

2．6雜交瘤細胞染色體數(shù)目

Balb／c小鼠脾細胞的染色體為40條，SP2／0骨髓瘤細胞的染色體為62條。統(tǒng)計結(jié)果表明，該細胞株染色體數(shù)介于90條～100條，大約為小鼠脾細胞和SP2／0骨髓瘤細胞染色體數(shù)目之和，說明為兩者融合產(chǎn)生（圖3）。

2．7McAb的特異性檢測

將3E2分別與犬細小病毒（CPV）、犬瘟熱病毒（CDV）、犬冠狀病毒（CCV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV）包被的ELISA板進行交叉反應(yīng)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3E2與CPV可發(fā)生陽性反應(yīng)，與CDV、CCV和CAV不發(fā)生反應(yīng)，表明制備的McAb與其他犬常見病毒沒有交叉反應(yīng)，制備的3E2單克隆抗體有良好的特異性（表2）。

2．8膠體金溶液的制備

制成的膠體金溶液日光下肉眼觀察透明清亮、顏色為酒紅色、無沉淀。經(jīng)紫外分光光度計檢測其最大吸收波長為525nm。

2．9膠體金免疫層析試紙的特異性

特異性試驗結(jié)果顯示犬瘟熱病毒（CDV）、犬冠狀病毒（CCV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV）在膠體金免疫層析試紙檢測線上均無條帶，為陰性。犬細小病毒（CPV）在檢測線上均出現(xiàn)特異性條帶，為陽性（圖4）。

3討論

犬細小病毒病傳播性強，發(fā)病率和病死率較高，且一年四季都有發(fā)生，絕大多數(shù)年齡、品種的犬類都可被傳染，但幼犬和純種犬更易被感染，病死率也高［14－15］。細小病毒感染犬類后，一旦發(fā)病治愈率特別低，沒有特效藥，早期確定犬細小病毒病并予以抗病毒、消炎、補液和止嘔等治療，可以提高療效和存活率，因此，對CPV的早期檢測就非常關(guān)鍵［16－19］。膠體金免疫層析試紙檢測方法只需將待測溶液加入試紙條中，靜止后一段時間觀察結(jié)果，不需要儀器設(shè)備來讀取結(jié)果，不需要操作者有專業(yè)技能，能減少很大檢測工作量和節(jié)省大量檢測費用，敏感性高，特異性好［20］。但目前我國市場上部分CPV試紙條主要以國外進口為主，價格較為昂貴，市場較為廣闊。我們以分離得到并純化的CPV為抗原，多次腹腔注射免疫小鼠獲得了能夠分泌抗CPVMcAb的脾細胞，ELISA試驗結(jié)果表明該雜交瘤細胞產(chǎn)生的McAb只與CPV發(fā)生特異性反應(yīng)，與CDV、CCV和CAV無明顯的交叉反應(yīng)，表明制備的3E2單克隆抗體有良好的特異性。另外，經(jīng)間接ELISA檢測，3E2腹水效價為1∶1．8×105。本試驗確定了標記的最佳條件，設(shè)定3E2為金標抗體、取蛋白濃度為1．5mg／mL的CPV多抗IgG標記為檢測線，蛋白濃度為1．0mg／mL的兔抗鼠IgG高免血清標記為質(zhì)控線，初步建立了膠體金免疫層析方法。本試驗建立的診斷方法特異性強，與其他3種犬常見病毒抗原無交叉反應(yīng)，具有較好的重復(fù)性，與ELISA方法結(jié)果一致，可用于CPV的快速檢測。下一步我們將在反應(yīng)條件、穩(wěn)定性及工藝上進一步改進，以期進一步提高檢測靈敏度。本研究分離并純化了CPV，經(jīng)免疫Balb／c小鼠后，通過雜交瘤技術(shù)獲得了1株高親和力和高特異性的雜交瘤細胞，經(jīng)鑒定制備出的McAb效價高、特異性強。并在此基礎(chǔ)上研發(fā)了膠體金免疫層析檢測試紙條，快捷準確，在臨床上具有很好的應(yīng)用前景，有一定的社會和經(jīng)濟價值，并為犬細小病毒的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

［1］趙建軍，閆喜軍，吳威．犬細小病毒：從起源到進化［J］．微生物學報，2011，51（7）：869－875．

［7］J薩姆布魯克，DW拉塞爾．分子克隆實驗指南［M］．3版．黃培堂，等，譯．北京：科學出版社，2002．

［8］周云朵，康真玉，陳月平，等．犬細小病毒的分離鑒定與生物學特性分析［J］．畜牧獸醫(yī)學報，2011，42（10）：1402－1408.

［9］孟凡進，于志海，邱昌偉，等．犬細小病毒地方株的分離與生物學特性分析［J］．動物醫(yī)學進展，2014，35（9）：15－19．

［10］馬輝，趙緒永．犬細小病毒VP2主要抗原表位區(qū)的原核表達載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達［J］．鄭州牧業(yè)工程高等專科學校學報，2012，32（2）：9－11．

［11］汪家政，范明．蛋白質(zhì)技術(shù)手冊［M］．北京：科學出版社，2000．

［13］錢紅，石峰，陳創(chuàng)夫，等．伯氏疏螺旋體外膜蛋白OspA膠體金免疫層析法快速檢測技術(shù)的建立［J］．中國病原生物學雜志，2014，9（12）：1075－1083．

［15］張仁舟，楊松濤，馮昊，等．中國國內(nèi)首次檢測到犬細小病毒CPV－2c［J］．中國病原生物學雜志，2010，5（4）：246－249．

［18］劉俊瑋，劉娟，杜林林，等．復(fù)方參芩對犬細小病毒致心肌組織Bcl－2和BaxmRNA的影響［J］．畜牧獸醫(yī)學報，2013，44（1）：122－128．

［20］樊淑華，王永立．膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用研究進展［J］．動物醫(yī)學進展，2014，35（10）：99－103．

作者:馬輝 權(quán)國輝 喬宏興 鄭鳴 趙緒永 王永芬 邊傳周 單位:河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院 鄭州職業(yè)技術(shù)學院材料工程系