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《果樹學報》2016年第四期

摘要：

【目的】對浙江紅肉柚類資源進行遺傳多樣性分析，為其搜集保護和合理利用提供理論依據。【方法】采用RT-PCR技術從11份浙江紅肉柚類資源中克隆6個類胡蘿卜素合成主鏈上的關鍵酶基因片段，分析所得基因片段中的SNP位點，對浙江紅肉柚類資源的遺傳多樣性進行精確研究。【結果】在11份供試材料中克隆到的八氫番茄紅素合成酶（PSY）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）、番茄紅素β環化酶（LBCY）、番茄紅素ε環化酶（LECY）和β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）的基因片段長度分別為348bp、521bp、426bp、429bp、403bp和459bp，其中PSY、ZDS、LBCY、LECY和BCH的基因序列在供試材料中分別有2、12、2、1和1個單核苷酸位點發生變異，多態性頻率分別為1SNP/174bp、1SNP/43.3bp、1SNP/213bp、1SNP/403bp和1SNP/459bp，而PDS基因序列在11份供試材料中高度保守，無核苷酸位點變異。利用Mega軟件NJ聚類法對6個基因片段的核苷酸序列進行遺傳多樣性分析顯示，11個樣品聚為3大類群。官南紅柚、文成紅心柚、處紅柚、木蘭柚親緣關系較近，歸于第一類；古磉柚、永嘉紅心柚、青田紅柚歸于第二類；紅肉蜜柚、麻步文旦、四季柚和紅心四季柚歸于第三類。【結論】浙江紅肉柚類資源果肉中類胡蘿卜素合成主鏈上的關鍵酶基因在編碼區除PDS均外存在SNP變異，其中ZDS的單核苷酸多態性頻率較高，PSY、LBCY、LECY和BCH4個基因片段的SNP變異位點較少，說明類胡蘿卜素生物合成基因在柚品種間總體較為保守，但這些變異可能是導致果肉紅色深淺程度的變因。根據6個基因片段的核苷酸序列的遺傳多樣性分析，官南紅柚、文成紅心柚、處紅柚和木蘭柚，古磉柚、永嘉紅心柚和青田紅柚，紅肉蜜柚、麻步文旦、四季柚和紅心四季柚，分別歸于親緣關系較近的同一類群。

關鍵詞：

柚；紅肉；類胡蘿卜素；基因片段；SNP分析

柑橘植物中汁胞為紅色類型的品種資源較為豐富，如粉紅色的紅肉葡萄柚（CitrusparadisiiMacf.）、鮮紅色的紅肉蜜柚（C.gransisL.）、橙紅色的紅廣橘（C.reticulataBlanco）、血紅色的血橙（C.sinensisL.）等，這些紅肉柑橘品種因色澤鮮艷以及特殊的營養價值而深受消費者歡迎。類胡蘿卜素和花青素是紅肉柑橘果肉呈色的兩類重要天然色素，其中類胡蘿卜素是大多數柑橘品種果實成熟時的主要色素，而花青素僅在血橙等少數柑橘品種中積累呈色[1]。迄今已發現的天然類胡蘿卜素約800多種[2]，在紅肉類型的柑橘品種中，番茄紅素和β-胡蘿卜素是主要的呈色色素[3]，二者含量的不同使柑橘果肉呈現粉紅、鮮紅和橙紅等顏色上的差異。以琯溪蜜柚的紅色芽變品種為例，紅綿蜜柚果肉中番茄紅素含量較低呈粉紅色，紅肉蜜柚果肉中番茄紅素含量提高20余倍，呈鮮艷的濃紅色[4]。在紅肉臍橙中當番茄紅素和β-胡蘿卜素含量均較高時，果肉為橙紅色[5]；而在紅玉柑等寬皮柑橘中，β-隱黃質的含量高達50%以上，果肉呈深紅色[1]。紅肉柑橘類型的果肉著色與番茄紅素、β-胡蘿卜素和β-隱黃質等類胡蘿卜素的積累密切相關，這些色素是類胡蘿卜素合成途徑中重要的中間產物。在類胡蘿卜素合成途徑中，PSY、PDS、ZDS、LECY、LBCY和BCH是合成主鏈上的6種關鍵酶，其中PSY是第一個限速酶，也是決定類胡蘿卜素積累總量的核心酶[6]。PSY催化牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸生成無色的八氫番茄紅素，然后在PDS和ZDS的連續催化下轉化成第一個具有顏色的類胡蘿卜素分子—番茄紅素。番茄紅素在LECY和LBCY作用下生成α-或β-胡蘿卜素，然后在BCH作用下轉化成β-隱黃質[7]。以上6種酶是參與紅肉柑橘果實著色的重要酶，目前在不同柑橘類型中已克隆到這些關鍵酶基因，成熟柑橘果實中類胡蘿卜素的積累是這些基因協同表達的結果[8]。

浙江省擁有多個紅肉類型的柚類資源，但果肉顏色的深淺程度差異較大，如四季柚、麻步文旦等果肉顏色為微紅色，永嘉紅心柚和青田紅柚等果肉顏色為粉紅色，而古磉柚、官南紅柚和處紅柚等果肉顏色為鮮艷的濃紅色[9]。我們在利用SRAP和SSR分子標記研究浙江柚類種質資源遺傳多樣性時發現果肉顏色與分子標記聚類結果表現出一定的一致性[10-11]，這促使我們著手研究不同紅肉柚類資源果肉著色機理的差異，從而探討紅肉柚類資源的遺傳多樣性。本研究在11份浙江紅肉柚類種質資源中克隆PSY、PDS、ZDS、LBCY、LECY和BCH共6個類胡蘿卜素生物合成途徑中的關鍵酶基因并檢測其單核苷酸多態性（SNP），分析類胡蘿卜素合成酶基因在供試材料中的遺傳多樣性，為柑橘類植物進行精確遺傳多樣性分析奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試材料果實成熟期采集11份紅肉柚類種質資源的果實（表1），分離汁胞組織經液氮速凍處理后放入-30℃低溫冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1果肉總RNA提取采用Plant/FungiTotalRNAPurificationKit（NorgenBiotek）試劑盒提取果肉總RNA，具體操作按說明書進行，取1.0μg提取總RNA樣品進行1%瓊脂糖電泳檢測。

1.2.2引物設計與合成根據GenBank中登錄的柑橘PSY、PDS、ZDS、LBCY、LECY和BCH共6個基因的全長或片段序列設計引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成（表2）。

1.2.3cDNA克隆及序列分析取1.0μg模板總RNA，加2μLOligo（dT）引物，加DEPC水至20μL，70℃變性10min，迅速放在冰上3min；然后依次加入5×RTbuffer10.0μL，dNTP(10mM)2.0μL，RNaseinhibitor(40U/ul)1.0μL，M-MLV(200U/μL)1.5μL，DEPC水15.5μL，混勻，42℃，1h；70℃，15min，4℃保存。以該cDNA為模板進行PT-PCR擴增。PCR反應體系為50.0μL，10×PCRBuffer5.0μL，2.5mMdNTP5.0μL，Primer(10μM)2.0μL，cDNA5.0μL，rTaq0.5μL，ddH2O32.5μL。所用試劑均來自寶生物工程（大連）有限公司。PCR反應程序為：95℃5min；95℃10s，55℃20s，72℃30s，擴增30個循環；72℃10min。RT-PCR產物經1.5%的瓊脂糖電泳后，切下目的片段，回收純化后送交至英濰捷基（上海）有限公司測序。

1.2.4數據分析采用Seqman7.1.0對測序結果進行剪切和拼接，ClustalX1.83比對序列，MEGA4.0分析堿基序列，鄰接法（Neighbor-Joining,NJ）進行聚類。

2結果與分析

2.1基因克隆產物分析果實中因含有大量多糖、多酚等次生物質能與RNA結合，很難從果實中提取大量的RNA[12]。利用Plant/FungiTotalRNAPurificationKit提取的柚果肉總RNA電泳條帶清晰、完整性較好，可以作為基因克隆的模板。以反轉錄合成的樣品cDNA為模板，經RT-PCR擴增后6對引物均獲得清晰的特異性條帶。經克隆測序后，PSY、PDS、ZDS、LBCY、LECY、BCH基因片段長度分別為348bp、521bp、426bp、429bp、403bp和459bp。6個基因片段中，LECY的T堿基含量最高，為31.0%，LBCY的A堿基含量最高，為31.2%，BCH的C、G堿基含量最高，分別為27.2%和23.3%（表3）。

2.2基因片段SNP分析運用ClustalX1.83進行序列比對和SNP分析，找出各基因片段在品種之間的堿基差異。PSY、ZDS、LBCY、LECY和BCH基因序列在11個樣品中分別有2、12、2、1和1個單核苷酸位點發生變異，多態性頻率分別為1SNP/174bp、1SNP/43.4bp、1SNP/213bp、1SNP/403bp和1SNP/459bp。PSY在第59和169個位點，ZDS在第34、61、69、88、136、152、163、221、235、247、377和383個位點，LBCY在第169和265個位點，LECY在第77個位點，BCH在第284個位點存在單核苷酸變異，PDS基因序列無核苷酸變異位點（表4）。

2.3基因片段的遺傳多樣性分析運用Mega軟件，對所得的6個基因片段序列采用NJ聚類法進行聚類分析。結果顯示，11個樣品聚為3大類群，第一類包括官南紅柚、文成紅心柚、處紅柚和木蘭柚，第二類包括古磉柚、永嘉紅心柚和青田紅柚，第三類包括紅肉蜜柚、麻步文旦、四季柚和紅心四季柚（圖3）。

3討論

紅肉柚果實不僅色澤具有吸引力，更以含有大量的β-胡蘿卜素和番茄紅素，具有清除自由基、增強免疫力等功能，而受到市場的歡迎[1]。浙江省作為東南沿海柚區重要組成部分，境內資源豐富，擁有許多紅肉類型的柚類資源。蒼南縣發現果肉鮮紅色的古磉柚和粉紅色的木蘭柚，青田縣存在果肉淡紅色的青田紅柚，麗水農科院從實生柚中選育出果肉鮮紅的處紅柚[9]。近幾年本課題組陸續發現果肉淡紅色的紅肉四季柚以及文成和永嘉等地的紅心土柚[13]。這些特征鮮明的地方紅肉柚類品種可作為珍貴的育種資源，但其來源、親緣關系還尚未明確。本研究從類胡蘿卜素合成角度探討柚類果實的成色機理，克隆類胡蘿卜素合成途徑中關鍵酶的基因片段進行SNP分析，研究浙江紅肉柚類資源的遺傳多樣性。SNP是目前最為精確的分子標記技術，其分辨率可達到單堿基變異，可以對親緣關系較近的材料進行精確的遺傳多樣性研究[14]。吳波等對柑橘GPAT和SOD基因片段進行SNP分析，分別發現14、18個核苷酸變異位點[15-16]。Savolainen等比較了擬南芥屬植物中乙醇脫氫酶基因的單核苷酸多態性，發現8個SNP位點[17]。Germano分析云杉種間SNP，鑒定出3個近緣種間的多態性[18]。Kota等對大麥7個基因型180個EST位點進行SNP研究，發現了72個SNP位點，并利用這些SNP位點進行大麥親緣關系研究[19]。本試驗中，紅心四季柚BCH片段第284個位點由A變為C，使得其與四季柚區分，顯示出SNP較強的分辨能力。ZDS基因片段發生12個單核苷酸位點發生變異，多態性頻率達到1SNP/43.4bp，但其他5個基因片段沒有或較少發生變異，這可能與材料為同屬植物有關，說明類胡蘿卜素生物合成基因在柚品種間較為保守，但這些變異可能是導致果肉紅色深淺程度的變因。

作者：林紹生 劉冬峰 陳巍 郭秀珠 徐文榮 黃品湖 單位：浙江省亞熱帶作物研究所