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《環(huán)境科學(xué)研究雜志》2014年第九期

1試驗(yàn)方法

1.1自然生物膜的培養(yǎng)采用以南京玄武湖湖水配置的BG11培養(yǎng)液［17］培養(yǎng)自然生物膜．采用聚氯乙烯材質(zhì)的彈性立體填料(200mm×0.5mm)作為載體，該材料的添加對水質(zhì)以及生物膜的生長沒有副作用;材料使用前用0.1mol/L的HCl溶液浸泡12h，并使用去離子水反復(fù)清洗，以去除雜質(zhì)．生物膜的培養(yǎng)在盛有30LBG11培養(yǎng)液的透明玻璃容器中進(jìn)行，容器中添加一定長度的彈性立體填料［18］．培養(yǎng)過程中，在容器口處用空隙尼龍網(wǎng)包扎以防止昆蟲以及其他雜物落入．保持水位不變，并定期觀察生物膜長勢情況．試驗(yàn)期間溫度保持在20～38℃之間．

1.2自然生物膜對染料的凈化試驗(yàn)試驗(yàn)先進(jìn)行自然生物膜的擴(kuò)大培養(yǎng)，即在自然光照的條件下利用BG11培養(yǎng)液于溫室下進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)．掛膜2個(gè)月左右后，彈性立體填料表面形成致密的深綠色生物膜，生物膜長勢成熟，生長旺盛．剪取每段長約20cm且掛有生物膜的彈性材料，置于5L的玻璃容器中，并設(shè)立試驗(yàn)組和對照組．其中，試驗(yàn)組中ρ(RhB)為0.5mg/L，對照組不添加RhB，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)．試驗(yàn)過程中，每天定時(shí)采集水樣，用聚醚砜微孔濾膜(孔徑0.45μm，濾頭直徑1.3cm)過濾，采用紫外可見分光光度計(jì)(UV2450，島津公司，日本)測定ρ(RhB)，做好相關(guān)記錄．采樣測試試驗(yàn)共進(jìn)行11d，當(dāng)試驗(yàn)組中ρ(RhB)處于較低水平(水質(zhì)較清澈)后試驗(yàn)結(jié)束．

1.3PLFA法測定微生物群落多樣性微生物PLFA的提取參照Bligh-Dyer修正方法［19］，以酯化C19∶0為內(nèi)標(biāo)，提取、純化、分析測定流程:取2g干燥生物膜，加20mL氯仿－甲醇－檸檬酸緩沖液(體積比為1∶2∶0.8)直接抽提樣品的總脂肪酸，提取的總脂肪酸經(jīng)硅膠柱(SPE-SI)分離為中性脂肪酸、糖脂肪酸和磷脂酸;其中磷脂酸溶于甲醇－甲苯(體積比為1∶1)溶液，加入10mL0.2mol/LKOH，37℃下酯化15min，用GC-MS(gaschromatograph-massspectrometry，sturn，Varian，美國)分析儀進(jìn)行不同分子的分離;采用PLFA標(biāo)準(zhǔn)譜圖(bacterialfattyacidstandards)和美國商品化的MIDI系統(tǒng)(microbialidentificationsystem)來識別與定量PLFA．

1.4Biolog法測定微生物功能多樣性Biolog方法是通過檢測樣品中微生物對Biolog公司生產(chǎn)的微孔板中的31種不同碳源利用情況來反映微生物群落水平的生理輪廓(communitylevelphysiologicalprofiles，CLPP)，以AWCD(averagewellcolordevelopment，顏色變化率)顯示微生物群落對不同碳源代謝的總體情況，其變化速率反映了微生物的代謝活性，最終的AWCD與微生物群落中能利用單一碳源的微生物的數(shù)目和種類有關(guān)［20］．Biolog法測定微生物功能多樣性采用Eco微孔板(BiologHayward，CA，USA)，每塊板有96個(gè)孔，分為3組，可以同時(shí)完成3個(gè)重復(fù)．每組32個(gè)孔，其中第1個(gè)孔不含任何碳源，作為對照，其余31個(gè)孔各含有1個(gè)單獨(dú)的碳源和四氮唑藍(lán)．具體操作:準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于5.00g干質(zhì)量(按含水量換算)的生物膜，置于滅菌的45mL生理鹽水(0.85%NaCl)中，室溫下180r/min振蕩30min后取出，靜置5min得到生物膜懸液;在超凈工作臺中吸取生物膜懸液1mL置于19mL事先滅菌的生理鹽水中進(jìn)行稀釋;將稀釋后的生物膜懸液接種于Eco微孔板中，每孔150μL，每樣1板(為3次重復(fù))，置于25℃暗箱連續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120、144h在590nm下測定OD值．每個(gè)樣品的AWCD的計(jì)算方法［21］:AWCD=［∑31i=1(Ci－R)］/31式中:Ci為第i個(gè)反應(yīng)孔的OD值;R為對照孔的OD值．另外，主成分分析及碳源利用分析均選用72h的OD值進(jìn)行計(jì)算．

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法采用MSExcel2007和Origin8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和繪圖;采用SPSS16.0中的Duncan法和DateReduction程序分別對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析和主成分分析．

2結(jié)果與討論

2.1凈化效果由圖2可見，自然水體生物膜對RhB染料具有一定的去除效果．隨著時(shí)間的增加，ρ(RhB)持續(xù)降低．在染料添加的第1天，RhB的去除率達(dá)到了29.2%，之后幾天每d的去除率降至3.9%左右，測試期內(nèi)總?cè)コ蕿?8.6%．第1天RhB去除率較高的原因可能是吸附在凈化過程的開始階段起到重要作用，吸附過程速率較快［3］．之后幾天仍保持一定的RhB去除率可能與生物吸收降解以及光降解有一定關(guān)系［22］;但是對照試驗(yàn)證明，該條件下光照對RhB的降解影響較小，總?cè)コ始s7.3%，因此，在該試驗(yàn)的采樣期間光降解作用可以忽略．WU等［10］對相關(guān)的研究報(bào)道進(jìn)行了綜述，指出微生物聚集體對污染物質(zhì)的去除機(jī)理主要有吸收、降解和吸附作用．自然生物膜作為一種微生物聚集體，其對RhB的凈化機(jī)理也可能包含了吸附作用、吸收和降解作用．康春莉等［23］研究證明，自然生物膜中的胞外聚合物的含量占總有機(jī)質(zhì)的80%以上，并且自然生物膜表面存在著大量的陰離子基團(tuán)(如羧基、羰基等)，這些電負(fù)性功能基團(tuán)對陽離子型污染物質(zhì)具有靜電吸附作用．Solis等［24］綜述了近幾年真菌、細(xì)菌和藻類在染料廢水脫色降解中的作用和效果，并指出利用微生物進(jìn)行染料脫色和降解是經(jīng)濟(jì)有效的方法．真菌、細(xì)菌和藻類均可以降解部分染料，特別是有些白腐真菌的脫色能力已有了大量的研究結(jié)果．Maulin等［25］分離出可以降解偶氮染料的細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)在pH為6，溫度為37℃時(shí)該菌對染料的去除率達(dá)80%以上．自然生物膜作為一種典型的微生物聚集體，含有大量的真菌、細(xì)菌和藻類，其中部分微生物可能對染料具有一定的凈化和降解效果;然而環(huán)境中的pH、溫度、含碳量和含氮量都可能會影響凈化效果，從而使得自然生物膜對RhB的去除效果仍處于較低水平．

2.2環(huán)境掃描電鏡(ESEM)觀察采用Quanta200環(huán)境掃描電鏡對自然生物膜在處理RhB廢水前后進(jìn)行ESEM(environmentalscanningelectronmicroscope，環(huán)境掃描電鏡)掃描攝像，結(jié)果如圖3所示．由圖3可見，對照組生物膜外表面比較光滑，界限分明，表面大量的絲狀物主要為藻類;添加RhB10d后的生物膜邊界處較為粗糙，并且呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，原本界限分明的絲狀物出現(xiàn)了增生．究其原因，可能是RhB這種酚類化合物接觸了自然生物膜上的微生物，與微生物細(xì)胞的蛋白發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而對微生物產(chǎn)生毒性脅迫，誘使其在表面分泌某種物質(zhì)，進(jìn)而與RhB結(jié)合，或?qū)⑵涓綦x于細(xì)胞體外來達(dá)到自我保護(hù)的目的．楊翠云等［26］研究表明，微囊藻毒素對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有一定的脅迫作用，細(xì)胞通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖的含量來抵抗外界脅迫，但隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)菌逐漸適應(yīng)了這種脅迫，恢復(fù)正常的生長．李淑英等［27］研究表明，Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+對大薸根際微生物的影響，隨微生物區(qū)系或生理類群和重金屬脅迫濃度的不同而不同，Hg2+對放線菌、細(xì)菌、真菌的毒性最強(qiáng)，Pb2+次之．

2.3RhB對自然生物膜微生物群落結(jié)構(gòu)特征的影響PLFA法通過測定微生物膜上的脂肪酸片段結(jié)構(gòu)，分析微生物群落結(jié)構(gòu)和生物量在不同環(huán)境中的變化．因?yàn)椴煌惾何⑸锖械腜LFA種類和數(shù)量均不相同，即PLFA和微生物類群數(shù)量之間存在著對應(yīng)的關(guān)系，因此該技術(shù)常被應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)的研究中，以定量描述土壤、底泥及海水等生境中微生物的群落結(jié)構(gòu)［28-29］．該研究采用PLFA法對微生物生物量以及各菌群進(jìn)行分析，將試驗(yàn)得到的生物膜微生物磷脂脂肪酸量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以判斷出微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性．PLFA以“總碳數(shù)∶雙鍵數(shù)ω雙鍵距離分子末端位置”命名;前綴a和i分別表示支鏈的反異構(gòu)和異構(gòu)，cy表示環(huán)丙烷脂肪酸;后綴c表示順式脂肪酸，t表示反式脂肪酸;10Me表示一個(gè)甲基側(cè)鏈在距分子末端第10個(gè)碳原子上．不同PLF段對應(yīng)的微生物群落如表1［30-31］所示．試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可見，對照組的總PLFA含量大于試驗(yàn)組，說明RhB的添加對生物膜微生物的生物量有一定的影響．RhB的添加使自然生物膜微生物的總PLFA含量減少52.23%，使細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量分別減少了75.81%、67.03%、100%．其中，放線菌幾乎消失，這可能是由于放線菌對染料的毒害性更受敏感所致．李淑英等［27］研究發(fā)現(xiàn)，微生物對Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+的敏感性表現(xiàn)為放線菌＞細(xì)菌＞真菌．但是，自然生物膜中的微生物并未完全被破壞，仍保持一定的數(shù)量和種類．為了獲得更多可靠信息，不考慮相對含量低于1.0%的單體PLFA，對其余含量較高的PLFA進(jìn)行主成分分析，提取的前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)83.66%，其中PC1(第一主成分)的貢獻(xiàn)率為61.06%，PC2(第二主成分)的貢獻(xiàn)率為22.60%，分析結(jié)果如圖4所示．由圖4(a)可見，試驗(yàn)組與對照組對于自然生物膜微生物群落PLFA的影響區(qū)分較明顯，其中，試驗(yàn)組微生物主要表現(xiàn)為與PC2相關(guān)的微生物種類，而對照組微生物主要表現(xiàn)為與PC1相關(guān)的微生物種類．由圖4(b)可見，革蘭氏陽性菌的特征脂肪酸(如i15∶0、i17∶0)及放線菌的特征脂肪酸〔如17∶0(10Me)〕在PC1上載荷值較高，說明PC1是它們的代表因子．a(chǎn)16∶0、14∶0是表征革蘭氏陽性菌的脂肪酸，在PC2載荷值較高，可以認(rèn)為PC2是它們的代表因子．綜上，RhB對自然生物膜上革蘭氏陽性菌和放線菌影響的差異較明顯．

2.4微生物群落功能多樣性添加RhB不僅影響了自然生物膜上微生物的群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量，也影響了其活性．由圖5(a)可見，在0～24h內(nèi)，對照組和試驗(yàn)組的微生物群落的AWCD均較低或只有輕微增加;24～48h內(nèi)2種微生物群落的AWCD隨時(shí)間表現(xiàn)出幾何級數(shù)增加;48h至培結(jié)束(144h)，2種微生物群落的AWCD隨時(shí)間的增速趨于緩慢直至達(dá)到平衡．無RhB添加的對照組AWCD始終大于試驗(yàn)組，表明接觸了RhB的生物膜微生物利用單一碳源的能力減弱了．究其原因，生物膜上的有機(jī)質(zhì)可能與RhB相互作用，降低了其生物有效性［32］．為研究生物膜微生物群落碳源利用多樣性的特點(diǎn)，以培養(yǎng)72h的樣品為例，對Biolog測試數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化變換后用于主成分分析，結(jié)果見圖5(b)．其中，PC1的貢獻(xiàn)率為23.59%，PC2的貢獻(xiàn)率為18.37%．由圖5(b)可見，對照組和試驗(yàn)組表現(xiàn)出了明顯的分布差異．Garland等［21］認(rèn)為，各樣本在空間上位置的不同是和碳底物的利用能力相關(guān)聯(lián)的．具體而言，各樣本在主成分空間不同軸上的差異是與聚集在該軸上碳源的利用能力相聯(lián)系的．因此，在RhB的影響下，自然生物膜微生物群落對31種碳源的利用表現(xiàn)出了差異，說明其活性受到了影響．但是這種影響是否對自然生物膜有利尚需進(jìn)一步判斷．另外對與PC1和PC2具有較高相關(guān)性的6個(gè)碳源進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示．由表3可見，在PC1上載荷較高的6種碳源中，有3種氨基酸、2種碳水化合物、1種多聚物;在PC2上載荷較高的6種碳源中，有3種碳水化合物，羧酸、多聚物和酚酸類各1種，說明影響PC1和PC2的碳源以碳水化合物為主．綜上，使自然生物膜微生物群落代謝多樣性表現(xiàn)出差異的主要碳源為碳水化合物類，其次為氨基酸類．

3結(jié)論

a)自然生物膜對水體中低濃度RhB具有一定的凈化作用，其對RhB的去除率，第1天達(dá)到29.2%，之后幾天每d的去除率降至3.9%左右，在測試期內(nèi)的總?cè)コ蔬_(dá)到68.6%．b)PLFA測定結(jié)果表明，RhB的添加使自然生物膜微生物的總PLFA減少52.23%，同時(shí)使細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量減少了75.81%、67.03%、100%．通過主成分分析，未添加RhB的自然生物膜與PC2正相關(guān)，而添加RhB的自然生物膜與PC1正相關(guān)，表明RhB在一定程度上改變了自然生物膜的微生物結(jié)構(gòu)．c)RhB的存在降低了自然水體生物膜微生物群落的AWCD．通過對31種碳源利用的主成分分析結(jié)果表明，RhB改變了自然生物膜上微生物群落對31種碳源的利用情況，但是其活性提高還是降低以及是否對自然生物膜有利尚需進(jìn)一步判斷。

作者：周徽馮彥房薛利紅何世穎王金花楊林章單位：中國科學(xué)院南京土壤研究所江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室