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《經濟動物學報》2014年第二期

1材料與方法

1．1質粒、毒株和主要試劑含小鵝瘟病毒SP株VP1基因的pGEX-4T-VP1質粒和大腸桿菌DH5α菌株由吉林農業大學動物科學技術學院預防獸醫學實驗室保存;質粒pGBKT7、酵母菌Y2HGold、YPDA、SD/-Trp、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His等預混營養缺陷培養基、AureobasidinA和X-α-Gal均購于ClonTech公司;SfiⅠ、BamHⅠ等限制性內切酶、dNTP、ExTaq酶、ExTaqBuffer等均購自TaKaRa公司;質粒小提試劑盒購自O-MEGA公司;DNAGelExtractionKit試劑盒購自AXYGEX公司;酵母質粒提取試劑盒購自TIAN-GEN公司。

1．2引物設計與合成根據GPVSP株的VP2和VP3基因序列設計引物，序列如下。P1/P5和P3/P5分別擴增帶有SfiⅠ部分酶切位點的VP2和VP3基因;以第一輪PCR產物為模板，P2/P5和P4/P5分別擴增帶有SfiⅠ完全酶切位點的VP2和VP3基因。引物由上海生工生物工程技術公司合成。

1．3VP2和VP3基因擴增以pGEX-4T-VP1質粒為模板，擴增VP2和VP3基因。PCR反應體系:pGEX-4T-VP1質粒2.0μL、10×ExTaqbuffer5.0μL、dNTP(10mmol/L)4.0μL、P1/P5或P3/P5各1μL(10μmol/L)、ExTaq0.5μL，ddH2O補足50μL。反應條件:95℃10min、95℃35s、62℃45s，72℃90s，共30個循環，72℃延伸10min。取1μL第一輪PCR產物為模板，用P2/P5或P4/P5分別擴增含SfiⅠ和BamHⅠ酶切位點的VP2或VP3基因，反應體系和退火溫度同第一輪PCR。

1．4pMD-18T-VP2和pMD-18T-VP3重組質粒的構建與鑒定將上述2種第二輪PCR產物分別經10g/L瓊脂糖凝膠電泳，并用AXYGEX的DNA回收試劑盒純化，克隆至pMD-18T載體中，再轉化大腸桿菌DH5α感受態。挑取陽性菌落，接種于液體LB培養基振蕩培養，參照OMEGA質粒提取試劑盒操作步驟提取質粒，再用SfiⅠ和BamHⅠ酶分步酶切鑒定，并送往上海生工公司測序。

1．5誘餌載體pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3的構建與鑒定將pMD-18T-VP2和pMD-18T-VP3重組質粒分別用SfiⅠ和BamHⅠ內切酶分步酶切后克隆至經上述2種內切酶酶切處理的pGBKT7載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態中。挑取陽性克隆，提取質粒，雙酶切確認，最后測序驗證。準確無誤的質粒可用于轉化酵母感受態細胞。

1．6誘餌載體pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3轉化酵母菌Y2HGold參照ClonTech公司酵母雙雜交試驗說明書，以PEG/LiAC法制備酵母菌Y2HGold感受態細胞。分別取pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3誘餌質粒5μL和10μL的蛙魚精子DNA(10mg/mL)混勻，同時以pGBKT7質粒作對照。加入200μLY2HGold酵母感受態中混勻;分別加入600μL滅菌的1.1×PEG/LiAC溶液，振蕩混勻，搖床30℃230r/min培養45min;加入80μL的二甲基亞砜后混勻。42℃熱激水浴30min，每隔5min振蕩1次;1.2萬r/min離心5s，棄上清，加入500μL滅菌生理鹽水重懸細胞;取100μL重懸菌液涂布于選擇培養基SD/-Trp，30℃培養3～8d，待長出白色菌落，挑取數個直徑2mm左右的單菌落液體培養，參照TIANGEN酵母質粒提取試劑盒說明書提取質粒，PCR驗證。

1．7誘餌載體pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3對報告基因自激活作用的檢測將轉化有pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP3和空質粒pGBKT7的酵母菌Y2HGold分別接種于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ada/-His、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA和SD/-Ade/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal/AbA不同營養缺陷型固體培養基中，30℃倒置培養3～6d，觀察菌落生長情況，檢測VP2和VP3基因對報告基因的自激活作用。

1．8pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3對酵母菌Y2HGold的毒性作用檢測從SD/-Trp營養缺陷平板上分別挑取轉化成功的pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP3和空載體pG-BKT7的酵母菌Y2HGold單菌落(2mm左右)，接種于SD/-Trp液體培養基中，30℃搖床振蕩培養16～20h，測量OD600，以檢測VP2和VP3蛋白對酵母菌的毒性作用。若試驗組OD600＞0.8，說明誘餌載體無毒性，反之則有毒性。

2結果

2．1VP2和VP3基因的擴增由圖1可見，以pGEX-4T-VP1質粒為模板，擴增VP2和VP3基因，大小分別約1800bp和1600bp。

2．2誘餌載體pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3的構建及鑒定pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3質粒PCR，擴增出約1800bp(VP2基因)和1600bp(VP3基因)的目的條帶;質粒經SfiⅠ和BamHⅠ雙酶切，分別得到約7300bp的載體條帶和2條對應的目的條帶(圖2)。測序結果與pGEX-4T-VP1中的VP2和VP3基因堿基序列一致。

2．3pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3轉化酵母菌Y2HGold轉化誘餌質粒pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3的Y2HGold酵母菌在SD/-Trp培養基上長出白色菌落。分別隨機挑取5個菌落，液體培養，將提取的質粒進行PCR驗證，結果分別在1800bp(VP2基因)和1600bp(VP3基因)附近有目的條帶(圖3)，說明誘餌質粒已成功轉化到Y2HGold酵母中。

2．4pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3對報告基因自激活作用檢測pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3轉化的Y2HGold酵母菌只在SD/-Trp缺陷固體培養基上生長，在其他缺陷培養基上均未見到菌落生長，也無變藍色現象;其生長特性與空載體pGBKT7轉化的酵母菌Y2HGold一致，表明誘餌質粒pG-BKT7-VP2和pGBKT7-VP3在酵母細胞中對報告基因沒有自激活作用。

2．5pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3對酵母菌Y2HGold的毒性作用檢測含有pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP3和空質粒pGBKT7的酵母菌Y2HGold接種至5mL的SD/-Trp液體培養基中，30℃搖床振蕩培養17h，OD600分別為1.763、2.198和2.035;重復2次，其值均大于0.8。說明這2個誘餌蛋白對宿主酵母菌均無毒性作用。

3討論

病毒感染細胞主要經過吸附、穿入與脫殼、生物合成、組裝與釋放等5個步驟，這5個步驟是病毒與細胞蛋白相互作用的結果，阻斷其中任何一個步驟均可抑制病毒的繁殖。硫酸乙酰肝素是許多細胞的表面成分，也是多種病毒的受體，但其類似物硫酸葡聚糖及其他聚陰離子物質在低于細胞毒性濃度下能抑制病毒的感染［9-10］。α-葡萄糖苷酶是乙肝病毒的一種細胞結合蛋白，參與乙肝病毒衣殼蛋白糖基化過程，與衣殼蛋白的正確折疊組裝有關，抑制α-葡萄糖苷酶的糖基修飾作用，可以在一定程度上抑制乙肝病毒的復制［11］。所以，病毒的細胞結合蛋白可以成為藥物靶標，為新型藥物的研發提供依據。本試驗成功構建了能用于酵母雙雜交系統篩選試驗的VP2和VP3蛋白誘餌載體，為尋找GPV細胞結合蛋白奠定基礎。

作者：徐浩孟繁興胡桂學董浩張雙齊宇李勇勇單位：吉林農業大學動物科學技術學院 吉林農業大學生命科學學院