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《昆蟲學報》2015年第十一期

摘要:

【目的】通過對中華蜜蜂Apisceranacerana嗅覺受體AcerOrco的表達及蛋白定位分析，闡明AcerOrco的表達特性，以期為進一步探索其功能提供理論依據。【方法】分別通過qRT-PCR技術和Westernblot技術對中華蜜蜂氣味受體AcerOrcomRNA及蛋白在內勤蜂和采集蜂5個組織部位(觸角、頭、胸、腹和足)中的相對表達量進行分析，采用免疫組化技術對AcerOrco蛋白的表達進行定位分析。【結果】定量結果顯示，AcerOrco轉錄本在內勤蜂和采集蜂各組織中均有表達，其中觸角中的表達量最高;該基因在采集蜂各組織中的表達量普遍高于內勤蜂。AcerOrco受體蛋白在內勤蜂和采集蜂各組織中也均有表達，在觸角和頭部的表達量明顯高于其他組織。定位結果顯示，在內勤蜂觸角中，AcerOrco主要在毛形感器中表達，板形感器中表達不明顯;在采集蜂觸角的板形感器和毛形感器中均有表達，但毛形感器中的表達更多一些。【結論】獲得了AcerOrcomRNA及其蛋白在內勤蜂和采集蜂各組織中的表達特性，并將這一蛋白表達定位于工蜂觸角的毛形感器和板形感器中。

關鍵詞:

中華蜜蜂;嗅覺受體;mRNA表達;蛋白表達;蛋白定位

昆蟲依賴靈敏的嗅覺系統對外界環境中的氣味分子進行識別，產生有利于其生存和繁殖的各種行為習性，以適應多變的環境。昆蟲的嗅覺識別過程有多種蛋白參與其中，主要包括氣味結合蛋白(odorantbindingproteins，OBPs)、化學感受蛋白(chemosensoryproteins，CSPs)和嗅覺受體(olfactoryreceptors，Ors)等(Pelosietal．，2006)。其中，Ors在這一過程中發揮著重要的作用。當外界環境中的氣味分子經昆蟲嗅覺感覺毛表皮上的微孔進入到感器淋巴液中，與OBPs結合形成復合體。復合體穿過感器淋巴液，與神經元樹突膜上的Ors相結合，啟動信號轉導過程，從而將化學信號轉變為電信號傳入大腦中樞神經系統(RützlerandZwiebel，2005)。昆蟲嗅覺受體具有7次跨膜結構，與脊椎動物G蛋白偶聯受體類似。但昆蟲嗅覺受體的N端位于細胞膜內而C端在細胞膜外(Bentonetal．，2006;Lundinetal．，2007)，這與G蛋白偶聯受體相反。因此昆蟲的嗅覺信號轉導過程并不是傳統的G蛋白模式，而是一種獨特的離子門控傳遞方式(Satoetal．，2008;Wicheretal．，2008)。昆蟲的嗅覺受體分為兩類，一類是傳統的嗅覺受體，此類嗅覺受體在不同昆蟲間的同源性比較低，可以識別氣味分子和信息素;另一類受體在不同昆蟲間高度保守，此類受體并無感受氣味的功能，但在大多數嗅覺神經元中與傳統嗅覺受體共表達，被稱作嗅覺共受體(olfactoryreceptorco-receptor，Orco)。Orco雖無識別氣味分子的功能，但在昆蟲的嗅覺識別過程中仍發揮著重要的作用。研究表明，Orco可以提高氣味分子與受體的結合效率(Wetzeletal．，2001;Sakuraietal．，2004;Neuhausetal．，2005;Nakagawaetal．，2005)，還可使傳統嗅覺受體在神經元樹突上準確定位(Neuhausetal．，2005)。作為一種典型的社會性昆蟲，蜜蜂有序維持整個蜂群的生活、繁殖以及外出采集等活動都是通過嗅覺識別氣味來傳遞的。蜜蜂還是一種重要的經濟昆蟲，對蜜蜂嗅覺的研究可以為制定合理的蜜蜂飼養管理方法，以及更有效地利用蜜蜂為作物傳粉提供一定的理論基礎。Robertson和Wanner(2006)在西方蜜蜂Apismellifera全基因組測序完成的基礎上，利用生物信息學方法，從中鑒定出170個Or基因，其中包含7個假基因。蜜蜂龐大的嗅覺基因家族，使它擁有超越其他昆蟲更靈敏的嗅覺。中華蜜蜂Apisceranacerana是我國的本土蜂種，較西方蜜蜂嗅覺更靈敏，善于利用零星蜜粉源(楊冠煌，2001)。因此中蜂是探究昆蟲嗅覺機制良好的實驗材料。

張林雅等(2012)利用RT-PCR技術對中華蜜蜂AcerOrco基因進行了克隆，使用Real-timePCR技術鑒定其在中華蜜蜂不同發育時期及不同組織的表達譜;利用免疫熒光定位技術對該氣味受體在中華蜜蜂工蜂觸角中進行亞細胞定位，推測AcerOrco與中蜂嗅覺發育和觸角感器功能密切相關。本課題組前期采用RACE技術獲得了AcerOrco的cDNA全長序列，采用熒光定量PCR及原位雜交技術，對AcerOrco轉錄本在工蜂及雄蜂不同發育階段的表達特點進行了研究，結果顯示AcerOrco在雄蜂和工蜂不同發育階段均有表達，工蜂中的表達量均在羽化出房前后達到最高，而雄蜂中的表達量在整個發育階段是逐漸增高的。利用原位雜交技術對AcerOrco在工蜂及雄蜂觸角上的表達進行定位分析，結果顯示AcerOr2的陽性雜交信號出現在觸角的毛形感器和板形感器神經元細胞中(Zhaoetal．，2013;趙慧婷等，2015)。本研究是在課題組前期已獲得Orco基因cDNA全序列并對其mRNA的時空表達特性進行分析的基礎上，利用qRT-PCR和Westernblot技術對Orco基因在中蜂內勤蜂和采集蜂不同組織的表達情況進行了定量分析，利用免疫組織化學技術對Orco基因在中蜂觸角的表達進行了定位，旨在對Orco受體的蛋白表達進行研究，并對該受體RNA水平和蛋白水平的表達情況進行關聯分析，驗證其表達是否一致，以期為進一步研究該基因的功能提供理論依據。

1材料與方法

1．1試蟲實驗用中華蜜蜂樣本均取自山西農業大學動物科技學院中蜂實驗場。在蜂群中加入一張新巢脾，蜂王產卵后記錄日期，在工蜂即將羽化出房的前一天，將該封蓋子脾脫蜂后帶回實驗室，放入34℃恒溫培養箱中。次日新蜂出房后，用無毒、無味的油漆在胸背部標記約200頭，迅即放回原蜂群中，之后于第3－15日期間隨機從巢內捉取被標記的工蜂共80頭，作為內勤蜂樣本。隨機從蜂箱前捉取足部攜帶花粉團的工蜂80頭作為采集蜂樣本。每次采樣，將采得的蜜蜂在活體狀態下用眼科鑷分別取其觸角、頭、胸、腹和足，迅速投入液氮中研磨至粉狀，置于－80℃冰箱保存，該樣本用于Real-timePCR和Westernblot。冰凍切片及免疫組織化學定位檢測用樣本為實驗當日于巢門前隨機捉取采粉歸巢的工蜂。

1．2主要試劑總RNA提取試劑Trizol、RT-PCR試劑盒PrimeScriptTMRTReagentKit、熒光定量試劑盒SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit等購自TaKaRa公司;蛋白抽提液、BCA蛋白質定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液、超敏ECL化學發光底物、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒以及4%多聚甲醛固定液購自博士德生物有限公司;熒光定量用引物由華大科技服務有限公司合成;包埋劑為日本Sakura公司產品。

1．3總RNA的提取及cDNA合成根據Trizol試劑說明書，提取內勤蜂和采集蜂各組織樣本的總RNA。采用微量核酸蛋白檢測儀檢測其濃度符合要求(OD值在1．8～2．1之間)后，按RT-PCR試劑盒說明書進行反轉錄合成第一鏈cDNA，作為PCR以及熒光定量PCR分析的模板。

1．4熒光定量PCR根據本課題組前期實驗得到的中華蜜蜂OrcocDNA全序列設計特異性引物(表1)，對該基因在中蜂內勤蜂和采集蜂不同組織中的mRNA表達水平進行熒光定量分析。Real-timePCR反應總體系為20μL，其中cDNA模版2μL，SYBRPremixExTaqTMⅡ(2×)10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0．8μL，ROXReferenceDyeⅡ(50×)0．4μL，ddH2O6μL。熒光定量的反應條件為:95℃預變性30s;循環條件95℃5s，6330s，共40個循環。每個樣本進行3次技術重復。以各樣品所對應的Rps18的Ct值為陽性對照，從而得到AcerOrco基因在內勤蜂和采集蜂各組織的表達譜。

1．5多克隆抗體的制備以中華蜜蜂OrcocDNA全序列設計并合成多肽抗原，免疫2只健康的新西蘭大白兔，之后采用G蛋白純化和免疫親和純化2種方法進行抗體純化。該部分實驗委托京天成生物技術(北京)有限公司完成。

1．6總蛋白的提取及Westernblot蛋白檢測按照抽提液試劑盒說明書，提取內勤蜂和采集蜂各組織樣品的總蛋白。用BCA蛋白質定量試劑檢測總蛋白濃度，10%SDS溶液調整各樣品總蛋白濃度一致。將濃度調整后的各組織總蛋白相同體積加樣到10%SDS-PAGE中進行電泳檢測。分離后的蛋白轉印70min到NC膜，脫脂奶粉封閉2h，TBST洗膜3次后，加入多克隆抗體，室溫搖床孵育1h后，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入羊抗兔IgG-HRP二抗，室溫孵育1．5h。充分洗膜后，用超敏ECL化學發光底物進行結果檢測。

1．7冰凍切片及免疫組織化學定位檢測采集回巢時后足攜帶花粉的工蜂，活體將觸角取下，在冰凍切片機中進行切片，厚度約5μm。粘片后用4%的多聚甲醛溶液固定30min，蒸餾水洗3次，每次10min。之后，于30%H2O2與純甲醇以1∶50(v/v)的混合液中，室溫浸泡30min，以滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水洗2次。在載玻片上粘有組織的位置滴加5%BSA封閉液，室溫放置40～60min，棄去多余的液體，滴加稀釋好的一抗，4℃孵育過夜，同時用PBS溶液代替一抗作為陰性對照。PBS洗3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30min。PBS再洗3次，滴加SABC，37℃孵育20min，PBS洗4次，每次10min。使用DAB顯色劑進行顯色，蒸餾水洗滌后用中性樹脂(二甲苯稀釋)進行封片。光學顯微鏡下觀察結果，用Image-ProPlus7．0軟件分析并拍照。1．8數據分析熒光定量結果應用MXPro-MX3000P軟件(Stratagene，美國)進行分析處理。根據標準曲線及熒光曲線的Ct值，采用2－△△Ct法進行數據分析(Livaketal．，2001)。采用SPSS17．0軟件中的ANOVA法進行單因素方差分析，Duncan氏法進行顯著性差異分析。所得結果均以平均數±標準誤(mean±SE)表示，并利用OriginPro8．0軟件進行圖形分析。

2結果

2．1多克隆抗體檢測結果AcerOrco多克隆抗體由京天成生物技術(北京)有限公司合成后，在實驗室對抗體進行質量檢測，選取的實驗材料為中蜂胸部組織。結果如圖1所示。從圖1中可以看出，陽性結果在目的蛋白分子量處條帶清晰，無雜帶，陰性結果的相應位置無明顯條帶，說明所制備的抗體確為目的蛋白抗體，且特異性較好。

2．2AcerOrcomRNA在中蜂內勤蜂和采集蜂不同組織的表達譜分析如圖2所示，AcerOrco的轉錄本在內勤蜂和采集蜂各組織中均有表達，在采集蜂各組織中的表達量普遍高于內勤蜂的表達量(足部除外)(差異顯著性用雙星號表示)，且兩者在觸角中的表達量均高于其他組織1000倍以上，差異極顯著(差異顯著性用大寫英文字母表示)。除觸角外，在內勤蜂各組織中，足部的表達量相對較高，其次為頭部和腹部，胸部的表達量最少;而在采集蜂各組織中，頭部和胸部的表達量相對較高，且兩組織中的表達量幾乎無差異，其次為腹部，而足中的表達最少。

2．3AcerOrco受體蛋白在中蜂各組織的表達分析AcerOrco在內勤蜂和采集蜂各組織中蛋白表達的Westernblot結果如圖3所示，AcerOrco在內勤蜂和采集蜂的觸角、頭、胸、腹和足各組織中均有表達。其中，在內勤蜂頭部中表達量最高，觸角中次之，其他3個組織中表達量差異不大;采集蜂觸角中表達量比頭部高，胸、腹和足中的表達量較少。

2．4AcerOrco在中蜂觸角中的表達定位本實驗用前期制備的多克隆抗體，與中蜂觸角切片進行免疫組織化學反應，采用藍色DAB染色，陽性結果為藍色點狀或圓盤狀，背景為淡藍色。對照組背景為無色或淡藍色，無明顯表達結果，說明實驗結果特異性較好。免疫組化結果顯示，AcerOrco在中蜂觸角鞭節中均有表達，且表達位置為感器神經元細胞層。AcerOrco在采集蜂觸角中的表達結果既有點狀(圖4中黑色箭頭所指)，又有圓盤狀(圖4中紅色箭頭所指)，點狀表達結果相對較多一些，推測AcerOrco在采集蜂觸角的板形感器和毛形感器中均有表達，但毛形感器中的表達更多一些;在內勤蜂的觸角中，主要為點狀表達結果，圓盤狀結果較不明顯，推測AcerOrco主要在內勤蜂觸角上的毛形感器中表達。從圖4中還可以看出，采集蜂觸角中的點狀表達結果明顯多于內勤蜂，意味著采集蜂AcerOrco表達量高于內勤蜂。

3討論

蜜蜂是一種營高度社會性生活的昆蟲，在一個蜂群里，工蜂承擔了除產卵之外的蜂巢內外的一切工作，內勤蜂是蜂群中的幼、青年工蜂個體，主要從事保溫、扇風、飼喂幼蟲和蜂王、清理巢房、夯實花粉、釀蜜以及筑巢等工作;采集蜂是蜂群中的壯年蜂，主要承擔著外出采集花蜜、花粉、水和樹脂等工作(Beshersetal．，2001)，因此采集蜂接觸到的氣味分子的種類和數量更多。觸角是昆蟲的主要嗅覺器官，上面分布有大量的嗅覺感器，而氣味受體基因主要在嗅覺感器的神經元細胞中表達(Vosshalletal．，2000)。蜜蜂觸角上分布有多種由皮細胞特化而來的化學感受器，其中，板形感器和毛形感器是最常見的2種感受器，這2種感受器皆與蜜蜂的嗅覺感受相關(Neuhausetal．，2005;Nakagawaetal．，2005)。本研究結果顯示，AcerOrco在內勤蜂和采集蜂觸角中的表達量均高于其他組織。AcerOrco在采集蜂中的表達量普遍高于內勤蜂(足除外)，這與內勤蜂和采集蜂在群內所承擔的工作有關，也與張林雅等(2012)的研究結果相一致。AcerOrco在中蜂內勤蜂和采集蜂各組織中均有表達，且兩者在觸角中的表達量均極顯著地高于其他組織，如內勤蜂觸角中的表達量是頭部的1600倍，胸部的3500倍，這使得頭部、胸部和腹部的表達量幾乎可以忽略不計，這與張林雅等(2012)報道的Orco在內勤蜂各組織中只在觸角和足中表達，而在采集蜂各組織中均有表達的結論相似。在其他昆蟲中對Orco表達特性的研究也有較多報道，如棉鈴蟲Heliothisarmigera、桃蛀螟Dichocrocispunctiferalis、斜紋夜蛾Spodopteralitura、中紅側溝繭蜂Microplitismediator、家蠶Bombyxmori等(Kriegeretal．，2005;王桂榮等，2005;張帥等，2009a，2009b;楊承遠，2010;陳茜等，2011;葛星等，2013)，其Orco基因或在觸角中特異性表達，或在觸角中表達量最高，與本研究結果基本相符，體現了Orco在不同昆蟲間功能的保守性。

目前對昆蟲嗅覺受體蛋白表達特性的研究報道較少。本研究采用Westernblot技術對AcerOrco蛋白在內勤蜂和采集蜂各組織的表達特性進行研究。結果顯示，AcerOrco在采集蜂觸角中表達最多，內勤蜂中頭部表達量稍多于觸角，這有可能是與實驗中我們對觸角蛋白溶液進行了濃縮，在此過程中產生了蛋白損耗有關。因此，總體上本實驗結果與前期熒光定量的實驗結果基本一致，這也從蛋白水平驗證了Orco的表達特性。迄今對蜜蜂嗅覺受體基因的表達定位研究，大多采用原位雜交的方法，例如Krieger等(2003)采用原位雜交的方法對西方蜜蜂AmelOr2mRNA的表達定位進行了研究，發現AmelOr2基因mRNA主要在位于工蜂觸角邊緣的板形感器和毛形感器的細胞中表達。張林雅等(2012)利用免疫熒光技術對中華蜜蜂Orco受體進行亞細胞定位，發現該受體同樣在毛形感器和板形感器中表達。而本課題組前期亦采用原位雜交技術對AcerOr2在中華蜜蜂觸角上的表達進行了定位分析(Zhaoetal．，2013;趙慧婷等，2015)，AcerOr2的陽性雜交信號出現在中蜂觸角底膜邊緣的一連串細胞中，而這些細胞恰恰處在毛形感器和板形感器中。本研究進一步采用免疫組化方法研究了AcerOr2蛋白表達特性，發現與原位雜交結果相似，AcerOrco在中蜂觸角鞭節的毛形感器和板形感器中均有表達。其他昆蟲的共受體基因，如DOr83b，AgOr7和MsexOr2等的表達情況也相類似(Foxetal．，2001;Kriegeretal．，2003;Malpeletal．，2008;Patchetal．，2009;Miuraetal．，2010)。同時，本研究結果還顯示，AcerOrco在采集蜂觸角中的表達明顯多于內勤蜂，這與mRNA的表達結果相一致。目前多數有關Orco的功能研究均表明，Orco并不直接感受氣味分子，需與傳統氣味受體Ors結合形成二聚體才能發揮嗅覺識別作用(Sakuraietal．，2004)，故今后可結合具體的Ors共同進行功能研究，以進一步探索中蜂優越的蜜粉源搜尋能力，為揭示中蜂的嗅覺識別機制提供一定的理論依據。

作者：張中印 楊珊珊 孟嬌 趙慧婷 姜玉鎖 單位：河南科技學院資源與環境學院 山西農業大學動物科技學院 山西農業大學生命科學學院