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《南京農業大學學報》2015年第五期

隨著生活水平的不斷提高，人們對豬肉品質的要求也越來越高。脂肪沉積是影響豬肉品質和營養價值的一個關鍵因素，因為脂肪沉積可以影響很多重要的肉質性狀，如背膘厚、肌內脂肪含量、瘦肉率等。另外，豬作為一個良好的動物模型，在研究人類肥胖候選基因的研究中發揮重要的作用。因此，開展豬的脂肪沉積機制研究具有重大意義。隨著定位克隆、物理作圖和候選基因等分子生物學技術的發展，研究人員已成功發現許多影響豬脂肪性狀的主效基因，如過氧化物酶體增殖物活化受體基因(PPARs)、肥胖易感基因(FTO)、脂蛋白脂肪酶基因(LPL)等。瘦素受體(LEPR)是一種跨膜受體，屬于Ⅰ類細胞因子受體家族，由細胞外的配體結合區、跨膜區及胞內區3部分組成。瘦素受體與瘦素(LEP)相互結合發揮著廣泛作用，如機體體質量平衡控制。在小鼠上，前人研究發現LEPRmRNA在越來越多的組織上有表達，包括心、肝、腎、肺、小腸、卵巢和脂肪組織等。在豬上，LEPRmRNA在脂肪組織、腦、肌肉、脂肪、肝、下丘腦、垂體和繁殖組織(子宮內膜、卵巢)上均有表達。但是，關于中國高脂肪含量豬和低脂肪含量豬LEPR的表達差異及表達量、編碼序列單核苷酸多態(cSNP)與肉質性狀關聯分析的報道還很少。蘇鐘豬是以太湖豬為親本培育的優質瘦肉型豬，肌間和肌內脂肪豐富，本試驗通過實時熒光定量PCR方法、免疫印跡和直接測序等技術，從mRNA表達、蛋白表達、cSNP挖掘和性狀關聯等方面分析了LEPR對脂肪沉積的影響。

1材料與方法

1．1試驗動物在江蘇洪澤鑫象公司，用背膘儀活體測定背膘厚度大小選取了10頭6月齡、(95±3)kg體質量的半同胞健康蘇鐘豬(高脂豬和低脂豬各半)，這些豬均在同一天被電擊昏后屠宰，之后參照屠宰程序［18－19］采集豬的心、肝、腎、眼肌(背最長肌)和背膘等組織樣，迅速置于液氮冷凍保存。同時，測定了這些試驗豬的脂肪沉積相關性狀，包括背最長肌橫切面積(求積儀，Haguang)、瘦肉率(SFK，Denmark)、背膘厚(游標卡尺，MNT)等，并根據背膘厚度和試驗豬左半邊胴體的前軀、中軀和后軀脂肪質量進一步確定了高脂豬和低脂豬(表1)。另外本實驗室保存有51頭蘇鐘豬肌肉樣或血樣，并有這些豬的耳號、出生日期和背最長肌性狀(橫切面積、pH值、肉色、大理石花紋評分和系水力)等記錄，筆者采用高鹽法［20］提取這些豬組織樣中的基因組，進行LEPR基因的cSNP研究。

1．2引物設計豬LEPR基因的cDNA(GenBank:NM_001024587)全長4050bp，其編碼序列為第16～3513bp。LEPR_1引物用于RT-qPCR，LEPR_2引物用于LEPR第18外顯子(2726～3464bp)的cSNPs檢測。所有引物序列均用Oligo6．0軟件設計，由上海英濰捷基(Invitrogen)生物公司合成(表2)。

1．3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)利用Trizol(Invitrogen，USA)/氯仿方法從豬組織樣中提取總RNA，以上述提取的總RNA為模板，利用FirstStrandcDNASynthesisKit試劑盒進行反轉錄，合成cDNA第一鏈(Fermentas，Lithuania)，25μL反應體系，試驗步驟參考說明書進行。利用實時熒光定量PCR儀(ABISteponeplus，USA)進行PCR擴增。反應體系如下:2×real-timePCRMasterMix(SYBRGreen)10μL，上下游引物(10μmmol•L－1)各1μL，模板(cDNA稀釋10倍)1μL，TaqDNAPolymerase0．3μL，加DEPC水到20μL(ABI，USA)。反應條件如下:95℃2min熱啟動HotStarTaq酶活性;94℃10s，60℃40s，共40循環;45～95℃，讀板時按0．1℃•s－1進行熔解曲線分析。內參基因為GAPDH。

1．4Westernblot檢測蛋白表達組織樣用蛋白裂解液裂解，提取出的總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒(Invitrogen，USA)檢測。Westernblot過程參照Patel等［23］和付言峰等［24］的方法，一抗用小鼠抗人LEPR抗體(mAb，sc-8391，SantaCruz，USA)，二抗用辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體(A0216，Beyotime，中國)。利用灰度分析軟件(Gel-Pro32)分析電泳條帶灰度比值(以GAPDH為內參)。

1．5直接測序法檢測cSNPs首先進行LEPR基因目的片段(cDNA第2726～3464bp，位于CDS區)的PCR擴增。反應體系(15μL):7μLPremixTaq(TaKaRa，China)，6μLddH2O，0．5μL各種引物(10pmol•L－1)和1μLDNA。反應條件:94℃5min;94℃30s，60℃30s，72℃60s，共30循環;72℃7min。利用ABI3730XLDNA測序儀(AppliedBiosystems，USA)對上述PCR產物進行直接測序，每個樣品測序2次，即正向和反向各測1次。測序序列和NCBI序列通過DNAMAN5．2進行比對，最終得到LEPR的cSNPs。

1．6數據處理與統計實時熒光定量PCR的數據利用2－ΔΔCT法［25－26］分析，得到LEPRmRNA的相對表達量。用SAS8．2統計軟件包的GLM程序進行LEPRmRNA、蛋白表達量、cSNP與脂肪沉積性狀之間的關聯分析。結果均以最小二乘均值±標準誤(LSmeans±SE)表示。

2結果與分析

2．1LEPRmRNA表達對脂肪沉積的影響組織樣中提取的總RNA利用分光光度計測定出的A260/A280結果大都處于1．8～2．1的區間，總RNA含量為1．60～2．22μg•μL－1，說明提取的RNA質量較高，可以進行后續的RT-qPCR試驗。RT-qPCR結果表明:LEPRmRNA在豬心、肝、腎、眼肌(背最長肌)和背膘中均有表達，且不同組織樣中的表達量差異顯著(P＜0．05)。其中背膘的表達量最高，且顯著高于其他組織(P＜0．05)，其次為背最長肌的表達量，且高脂豬的表達量顯著高于低脂豬(P＜0．05)(圖1)。由于高脂豬的眼肌(背最長肌)面積和瘦肉率顯著低于低脂豬(表1)，即高脂豬的脂肪沉積量顯著高于低脂豬，結合文獻報道，筆者推測豬脂肪沉積增加，引起LEPRmRNA表達量升高，促進脂肪分解，控制豬只體質量的平衡。

2．2LEPR蛋白表達對脂肪沉積的影響Westernblot結果表明:豬LEPR蛋白(NCBIProtein:NP_001019758)在蘇鐘豬的心臟、肝臟、腎臟、背最長肌和背膘組織中均有表達，且不同組織間表達量差異顯著(P＜0．05)，其中背膘中的表達量最高，顯著高于其他組織樣，其次為背最長肌，而腎臟中的LEPR蛋白表達量最低(圖2)。高脂豬的LEPR蛋白表達量顯著高于低脂豬(P＜0．05)(圖2)，這與LEPRmRNA的表達結果一致。考慮到高脂豬的背膘厚顯著高于低脂豬，背最長肌面積和瘦肉率顯著低于低脂豬(P＜0．05)(表1)，即高脂豬的脂肪沉積更高，聯系到其蛋白表達情況，筆者分析豬肉脂肪沉積增加(背膘增加)，可能引起LEPR蛋白表達量升高，從而更好發揮LEPR促進脂肪分解、控制體質量平衡的功能。

2．3LEPR的cSNPs挖掘筆者對LEPR基因cDNA序列第2726～3464bp(位于CDS區，覆蓋了第18外顯子92．65%的序列)進行了直接測序掃描，結果發現3個cSNPs，即c.2856C＞T，c．2935C＞T和c．3155C＞T。3個位點的突變均為C→T的突變。這3個cSNPs中，只有c.2856C＞T位點有3種基因型，呈現多態性，分別為CC、CT和TT基因型(圖3)。

2．4LEPR的cSNPs對脂肪沉積的影響LEPR的cSNPs(c.2856C＞T)基因型與脂肪沉積相關肉質性狀的關聯分析結果表明:對于背最長肌面積/體質量、瘦肉率、pH值和肉色評分，CC基因型顯著大于TT基因型(P＜0．05);相反，對于肉色L*值、肉色a*值和大理石花紋評分，CC基因型顯著小于TT基因型(P＜0．05)。考慮到背最長肌面積/體質量、瘦肉率和肉色a*值，低脂豬極顯著大于高脂豬(P＜0．01)。筆者推測，TT基因型豬關聯的肉質性狀中，背最長肌肉色更亮、大理石花紋更豐富、瘦肉率和眼肌面積更低，與高脂豬的肉質性狀結果類似，即TT基因型更有利于豬的脂肪沉積，T等位基因是脂肪沉積有利等位基因(表3)。

3討論

脂肪沉積可以影響豬的肉質性狀，如背膘厚、背最長肌面積和肌內脂肪含量等，這些肉質性狀又進一步影響豬肉的品質，如適口性、香氣、嫩度等，直接決定了豬肉的品質和價格，所以豬育種工作者對其越來越重視。關于影響脂肪沉積的基因有肥胖易感基因(FTO)、氟烷基因(halothane)［27］、激酶插入域受體(Kinaseinsertdomainreceptor，KDR)基因等。而本文的瘦素受體(LEPR)基因與瘦素(leptin)相互結合后，在體質量平衡、脂肪沉積過程中發揮著重要的作用。關于其在中國本地豬種不同脂肪含量豬中的研究還鮮有報道，所以本試驗開展了LEPR的mRNA和蛋白表達及cSNPs對豬脂肪沉積的影響研究。RT-qPCR結果表明:LEPRmRNA在蘇鐘豬的心、肝、腎、背最長肌和背膘5種組織中均有表達，且背膘中的表達量顯著高于其他組織，這與前人報道的LEPR在其他品種豬的表達結果一致。蘇鐘豬高脂豬的脂肪沉積高于低脂豬，且高脂豬LEPRmRNA表達量顯著高于低脂豬，說明脂肪沉積越高，LEPRmR-NA表達量越高。推測原因可能是脂肪沉積增加引起LEPR表達量增加，從而促進脂肪分解，控制豬只體質量平衡。有研究對波蘭5個品種豬分別添加能量飼料后，LEPR在各品種豬肌肉組織的表達量均隨著年齡增長而顯著升高。

Westernblot結果表明:LEPR蛋白在蘇鐘豬的心、肝、腎、背最長肌和背膘中均有表達，其中背膘中的表達量最高，且高脂豬的蛋白表達量顯著高于低脂豬(P＜0．05)，這與LEPRmRNA表達趨勢相同。高脂豬比低脂豬的脂肪含量高、瘦肉率低，而LEPRmRNA和蛋白的表達量都更高，前人對LEPR配體leptin也有類似的研究結果，其發現瘦肉率高的豬leptinmRNA表達量更低，說明瘦肉率與leptin的表達量也成反比。另有報道，LEPR在高肌內脂肪含量豬背最長肌的表達量顯著高于低肌內脂肪含量豬。PCR-sequencing和關聯分析結果表明，LEPR部分編碼序列中檢測到3個cSNPs多態位點，其中c.2856C＞T多態位點對瘦肉率、肉色、大理石花紋評分等肉質性狀影響顯著，T等位基因為脂肪沉積的有利等位基因。這個SNP突變不直接引起氨基酸的改變，但其可以通過與其他SNP的連鎖不平衡間接引起氨基酸的改變。有研究表明，LEPR多態性顯著關聯著杜洛克×長白×大白三元雜交豬的脂肪含量、脂肪分布和脂肪組成，LEPR多態性顯著關聯韓國本地豬×大白二元雜交豬的系水力、肌內脂肪、膽固醇和風味評分。綜上所述，LEPRmRNA和蛋白在蘇鐘豬的背膘和背最長肌中均有高表達量，且高脂豬的LEPR表達量顯著高于低脂豬，可能是脂肪沉積的增加引起LEPR的表達量增加，從而使LEPR更好得發揮其“促進脂肪分解，控制豬只體質量平衡”的作用;LPER多態位點c.2856C＞T中T為脂肪沉積的有利等位基因。上述結果表明LEPR基因對豬的脂肪沉積有一定影響，可以作為蘇鐘豬肉質改良育種中重要的候選基因。

作者：付言峰 李蘭 周艷紅 李碧俠 方曉敏 王學敏 任守文 單位：江蘇省農業科學院畜牧研究所/江蘇省農業種質資源保護與利用平臺 中國農業大學動物醫學院 國家獸用生物制品工程技術研究中心 南京農業大學動物科技學院